[发明专利]人类非小细胞肺癌组织基因特异位点甲基化水平检测引物及其应用

说明书

本发明涉及一种人类非小细胞肺癌组织基因特异位点甲基化水平检测引物及其应用，所述检测引物的序列包括上游扩增引物序列、生物素修饰下游扩增引物序列、焦磷酸测序引物序列。检测引物可再制备焦磷酸测序试剂盒中应用。试剂盒包括序列基因PCR扩增反应液、Taq DNA聚合酶、对照质控品、焦磷酸测序引物、包装盒。所述序列基因扩增PCR反应液，由PCR反应缓冲液、一对序列基因特异性上有扩增引物和生物素修饰的下游扩增引物组成。试剂盒使用方法：PCR扩增产物经DNA变性过程，纯化得到含生物素修饰的下游扩增引物的待测序单链，并和焦磷酸测序引物结合成杂合体，然后使用焦磷酸测序仪进行序列的检测与分析。

技术领域

本发明涉及一种人类非小细胞肺癌组织基因特异位点甲基化水平检测引物，属于人类非小细胞肺癌组织基因技术领域。

背景技术

肺癌根据病理分型分为非小细胞肺癌(non small cell lung cancer,NSCLC)和小细胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC),非小细胞肺癌包括鳞状细胞癌(Squamouscellcarcinoma)、肺腺癌(Lung adenocarcinoma)和大细胞肺癌(Large cell lungcancer)。在诊断方面，肺癌常规的临床诊断主要靠放射线检查，如CT等，以及穿刺细胞学检查及脱落细胞学检查。这些检查都有一定的局限性，很难区分肺占位的良恶性，即使病理检查，也有假阴性的可能。为了避免对具有良性生物学行为的肺结节进行过度治疗，不断寻求新的肿瘤标志物，以提高肺癌的诊断水平成为本领域的研究热点。今年来研究较多的肿瘤标志物主要有循环肿瘤细胞(circulating tumor cells，CTCs)，循环肿瘤DNA(circulating tumorDNA,ctDNA),微小核糖核酸(micro RNA，miRNA)，外泌体(exosomes)，肿瘤血小板(tumoreducated platelets，TEPs)等。CTCs的检测可以分为利用物理特性(大小、密度、弹性)的直接分离方法，利用CTCs的细胞膜或者细胞内部的特殊物质(上皮细胞粘附分子、特异性抗体、酶类)进行的间接的分离检测方法[2-5]。Ilie等[6]采用CT扫描联合CTC检测识别肺癌术后隐匿性转移的高危患者，对CT未发现肿瘤转移但CTC检测阳性的患者进行长达4年的随访，结果这些已切除肿瘤的患者最终都出现了CT确认的肿瘤进展，这表明CTC检测有助于评估肺癌术后复发的风险。miRNA的传统检测方法包括Northern blot、微阵列法(microarray)、RT-PCR，其中RT-PCR也是最常用、应用较为广泛的。传统方法存在操作繁琐、灵敏度低等缺点，因此许多灵敏度高、特异性好、简便快捷的检测手段应运而生。包括指数扩增反应(exponential amplification reaction,EXPAR)、滚环扩增技术(rollingcircle amplification,RCA)、辅助酶目标核酸分子再循环策略(enzyme-assisted targetrecycling,EATR)等。Wozniak等[7]评估了100例早期NSCLC(I～ⅢA期)患者和100名健康对照者的样本的754种miRNA，筛选出由24种miRNA组成的集合具有最佳的区分效果，曲线下面积达0.92。研究[8]显示血清和血浆标本中的ctDNA含量不同。据报道血浆是ctDNA较好的来源[9]。血清中的ctDNA虽然比血浆多，但血浆中的突变载荷更高。因此可以对配对的血浆/血清样品同时分析，有助于提高分析灵敏度[10-12]。Chen等[13]发现，与常规肿瘤标志物相比，ctDNA在早期肺癌的阳性率要高一些。尽管对于肿瘤标志物的研究很多，方法也不同，但单一的肿瘤标志物因敏感性及特异性不高不能被广泛应用。一些标志物可作为辅助诊断方法，但其真正应用于临床还需要做大量工作。