[发明专利]一种抗鸡CD86单克隆抗体的制备方法及应用

说明书

本发明涉及一种抗鸡CD86单克隆抗体的制备方法及应用，通过原核表达系统制备鸡CD86重组蛋白，并将其作为免疫原制备了抗chCD86单克隆抗体，该抗体能特异性识别chCD86天然蛋白。本发明填补了鸡CD86蛋白免疫检测的知识和技术空白，并为研究CD86在鸡生理与病理条件下的表达变化提供了有效工具。本发明中的chCD86抗体易于大量生产，便于后期在养鸡业和家禽免疫学基础研究中的应用。

技术领域

本发明涉及一种抗鸡CD86单克隆抗体的制备方法及应用，具体涉及重组蛋白表达、单克隆抗体的制备及其应用，属于禽免疫学、生物制品和诊断试剂领域。

背景技术

CD86作为一种关键的免疫共刺激分子，通常表达于巨噬细胞(MΦ)、树突状细胞(DC)以及活化的B细胞表面[1]。在T细胞通过TCR-多肽-MHC复合物发生活化时，CD86可与另一个共刺激分子CD80形成异源二聚体，之后与T细胞上的CD28或CTLA-4受体相结合，提供T细胞活化或抑制的第二个共刺激信号；该信号轴在启动、维持和调节T细胞活化、增殖或抑制等方面具有至关重要的作用[2]。目前人和鼠CD86已得到深入研究，利用抗人或鼠CD86抗体能够深入研究抗原提呈细胞(如MΦ、DC等)的表型和功能以及T细胞激活机制[3]。然而，截至目前，关于禽类特别是鸡CD86(chCD86)的研究仍十分匮乏。由于缺乏功能性的抗chCD86抗体，至今不能准确定义和研究鸡抗原递呈细胞的表型和功能。

在小鼠上，CD86基因编码一个由309个氨基酸组成的糖蛋白，分子量为34.7kDa，其包含一个23个氨基酸的信号肽，具有明确的胞内区，跨膜区和胞外区定位，其胞外区约为第24-244位氨基酸；天然的CD86蛋白高度糖基化，分子量约为70kDa之间[4]。相较之下，鸡CD86基因编码区包含875个碱基，编码283个氨基酸，包含一个19个氨基酸的信号肽以及5～6个糖基化位点。通过TMHMM-2.0网址预测鸡CD86胞外区序列约为第20-244位氨基酸，与小鼠胞外区序列基本一致。但目前尚不清楚天然的鸡CD86蛋白的真正分子量大小。

CD86在T细胞免疫应答中发挥关键作用。有研究表明，CD86与T细胞表面受体CD28的结合能够刺激T细胞活化并启动适应性免疫应答[5]。在肿瘤免疫中，通过阻断CD86与T细胞表面受体CTLA-4的结合，促进T细胞激活，能够有限抑制肿瘤的生长，起到了抗肿瘤作用[6]。在移植排斥反应中，CD86和CTLA-4通路在控制T细胞对外来抗原反应中扮演着重要角色，为移植排斥反应研究提供了新的靶点。

在本发明中，我们公开了一种的鸡CD86真核及原核重组蛋白制备方法，制备了抗鸡CD86单克隆抗体1C2。该单抗经Western blot等技术可特异性识别鸡CD86真核及天然蛋白，并能用于流式细胞术检测鸡巨噬细胞膜表面表达的CD86蛋白。该单抗的获得为研究禽免疫学提供了重要工具。

发明内容

本发明的目的是提供一种抗鸡CD86单克隆抗体的制备方法及应用，用以解决上述背景技术提出的技术问题；本发明要解决的技术问题是成功制备出重组chCD86原核蛋白及真核蛋白。本发明还需解决的技术问题是制备抗鸡CD86的单克隆抗体。并利用该抗体实现检测鸡抗原递呈细胞(巨噬细胞和树突状细胞)表面表达的天然CD86蛋白。

为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：一种制备重组鸡CD86蛋白的原核表达方法，将chCD86胞外区片段构建到原核表达载体pET-28a，经转化大肠杆菌中进行诱导表达，获得重组鸡CD86蛋白。

chCD86胞外区序列来自Genbank序列(Genbank登录号:EF554724.1)。

一种制备重组鸡CD86蛋白的真核表达方法，完整的鸡CD86基因被构建到真核表达载体pCAGGS(pCAGGS-chCD86)，重组质粒转染DF-1细胞表达鸡CD86真核蛋白。

完整鸡CD86基因序列来自Genbank序列(Genbank登录号:EF554724.1)。