[发明专利]一种前体发酵法制备分子量可控的右旋糖酐技术

权利要求书

1.一种前体发酵法制备分子量可控的右旋糖酐技术，其特征在于制备过程主要分为以下三个步骤：

步骤（1）采用改良MRS培养基培养肠膜状明串珠菌到对数中后期，优选培养至OD₆₀₀达到4～6；

步骤（2）把步骤（1）得到的菌种转接到含有前体和蔗糖的培养基中，进行发酵培养，直接得到重均分子量接近产品要求的右旋糖酐，前体优选重均分子量比目标右旋糖酐重均分子量小且分布系数1.6以内含α-1，6键为主的右旋糖酐；

步骤（3）对步骤（2）所得含右旋糖酐溶液，经过除杂，然后进行膜分离纯化或在膜处理基础上进行乙醇沉淀分离纯化，得到目的重均分子量右旋糖酐，进一步干燥得到产品。

2.根据权利要求1所述，步骤（1）采用的改良MRS培养基配方是每升含酪蛋白胨 10.0克，牛肉浸粉 5.0克，酵母浸粉 4.0克，葡萄糖 10.0克，右旋糖酐T20 3.0克，磷酸氢二钾2.0克，柠檬酸三铵 2.0克，醋酸钠 5.0克，硫酸镁 0.2克，硫酸锰 0.05克，吐温80 1.0克，氯化钙2.0克，pH6.2左右；步骤（2）所述含蔗糖和前体培养基配方是前体10～50g/L，蔗糖100～500g/L，蛋白胨2～6g/L，乙酸钠1.5～5g/L，磷酸氢二钠0.1～0.2g/L，磷酸二氢钾0.03～0.06g/L。

3.根据权利要求1所述，步骤（2）的发酵培养，其特征在于使用含蔗糖和前体培养基，灭菌后，接种产右旋糖酐蔗糖酶的肠膜状明串珠菌菌种，进行发酵转化，其中培养基的氮源如蛋白胨单独灭菌后以补料方式加入发酵罐。

4.根据权利要求1所述，步骤（2）的肠膜状明串珠菌，优选生产右旋糖酐的肠膜状明串珠菌，如菌株CMCC(B)34991，CICC-21725或CICC-20074等，可以从菌种保藏机构获得。

5.根据权利要求1所述，步骤（3）的除杂，是先把步骤（2）得到含右旋糖酐溶液在70℃加热或不经加热，进行高速离心或加入活性炭吸附结合板框过滤或以微滤膜进行膜过滤，除去菌体、色素、蛋白等杂质；步骤（3）所述膜分离，是对除杂后的右旋糖酐溶液，用两级膜分离获得目的重均分子量右旋糖酐，通常先用100kDa～500kDa超滤膜除去大于目标糖酐限度要求的大分子右旋糖酐，再用3000Da～100kDa超滤膜除去微分子右旋糖酐、异麦芽低聚糖、果糖和少量未反应完的蔗糖，获得目的右旋糖酐，进一步干燥得到右旋糖酐产品；步骤（3）所述膜处理基础上的乙醇沉淀分离，是对除杂后的右旋糖酐溶液，先用3000Da～8000Da的超滤膜去除溶液中大部分的果糖、蔗糖和低聚糖等杂质，再浓缩目的右旋糖酐溶液至浓度10%～25%，再加入85%以上浓度的乙醇，边搅拌边缓慢加乙醇至终浓度35%，使大分子右旋糖酐沉淀，经3～5μm孔径过滤器过滤分离大分子右旋糖酐，分离的滤液，再根据目标右旋糖酐特点，边搅拌边缓慢加入乙醇到终浓度45%～67%，40℃静置2～36小时，分离得到目标右旋糖酐沉淀，再加水至糖酐浓度10%～30%，加热溶解，再次加80%以上浓度乙醇至浓度50%～65%进行沉淀，右旋糖酐沉淀，经离心，烘干，粉碎，得右旋糖酐产品。

6.一种生产右旋糖酐的方法，其特征在于如权利要求1所述，其发酵培养是在转速100～300转/分钟，培养温度20～30℃，蛋白胨以40克/升配制121℃单独灭菌20分钟后进行分批补料或连续补料方式加入到培养基中。

7.一种生产右旋糖酐的方法，其特征在于如权利要求1所述，所采用前体是上一批次发酵转化得到的右旋糖酐发酵转化液经膜分离得到的小于目标产品重均分子量的右旋糖酐。

8.一种生产微分子右旋糖酐的方法，其特征在于如权利要求1所述，所采用前体是右旋糖酐T5或低聚异麦芽糖，当右旋糖酐重均分子量达到5000～10000Da时，结束发酵转化，进行分离纯化，所得微分子右旋糖酐可作为合成更大分子右旋糖酐的前体。