[发明专利]一种前体发酵法制备分子量可控的右旋糖酐技术

说明书

本发明公开一种前体发酵法制备分子量可控的右旋糖酐技术，通过添加前体控制分子量合成得到右旋糖酐产品，其产品种类包括右旋糖酐T70，右旋糖酐T40，右旋糖酐T20以及右旋糖酐T10。其制备过程主要分为三个步骤：步骤一，采用MRS培养基接种高产右旋糖酐蔗糖酶的肠膜状明串珠菌生产菌种到对数中后期；步骤二，把菌种转接到加入前体的培养基，进行发酵培养，直接得到重均分子量接近产品要求的右旋糖酐；步骤三，对含右旋糖酐的溶液进行除杂，然后进行膜分离或在膜处理基础上进行乙醇沉淀分离，进一步干燥得到目的重均分子量右旋糖酐。相比传统方法，本发明直接发酵得到目的分子量比例高的右旋糖酐，只需两级膜分离或两级乙醇沉淀分离，工艺简单，可控性强，降低生产成本低，相比传统工艺更加环保、品质高。

技术领域

本发明涉及生物技术领域的发酵工程或生物催化技术领域，具体涉及一种前体发酵法制备分子量可控的右旋糖酐技术。

背景技术

右旋糖酐是由肠膜状明串珠菌右旋糖酐蔗糖酶（Dextransucrase，EC 2.4.1.5）转化蔗糖得到的葡聚糖，其α-1，6键的比例通常在95%左右，亲水性好，可溶性高。右旋糖酐T70可作为代血浆，右旋糖酐T40和右旋糖酐T20可作为大输液的原料。右旋糖酐T10通过与Fe3+络合，制备的右旋糖酐铁是目前国内外公认较好的仔猪补铁针剂。右旋糖酐还可以用于制备右旋糖酐硫酸酯，用于降血脂及抗动脉粥样硬化剂。传统右旋糖酐生产是在含蔗糖培养基中接种肠膜状明串珠菌，发酵培养得到粘度很高的发酵液，其中大分子右旋糖酐占大部分，仅有少量分子量低于100kDa的小分子右旋糖酐。

传统工艺直接合成大分子右旋糖酐，要得到医用右旋糖酐，一般需要对大分子右旋糖酐用酸水解或酶水解。但水解产物往往分布较宽，产物不集中，需要进行复杂的乙醇沉淀分离，分别划分得到右旋糖酐T70、右旋糖酐T40和右旋糖酐T20，以及更小的右旋糖酐T10，右旋糖酐T5等。或者通过多级膜分离水解产物获得各种右旋糖酐。

有研究，通过在发酵或酶发酵转化工程中添加右旋糖酐酶或者产右旋糖酐酶的微生物，不经过合成大分子阶段直接获得1000～100000Da分子量为主的右旋糖酐，再进行乙醇分级沉淀或多级膜分离纯化。内切型右旋糖酐酶对大分子右旋糖酐亲和性更好，优先切割大分子右旋糖酐。但实质上，各种分子量的右旋糖酐都是右旋糖酐酶的底物，右旋糖酐酶水解右旋糖酐主要是随机切割。水解反应到后期，右旋糖酐都水解成为低聚糖。右旋糖酐酶随机切割产生的小分子右旋糖酐，虽然表现比酸水解更好，但水解产物倾向于在5000Da以下集中。当目标产物是重均分子量5000Da～10000Da范围的微分子右旋糖酐时，右旋糖酐酶很容易生产很大比例重均分子量小于3000Da的右旋糖酐，工艺难以控制，糖酐得率低。

采用乙醇沉淀分级分离右旋糖酐时，传统工艺生产1吨右旋糖酐需用乙醇的数十吨，乙醇的损耗6吨以上。乙醇损耗和蒸馏回收成本占右旋糖酐成本的比例很高，且有一定的安全隐患。含乙醇工艺污水处理难度高，处理成本比普通污水高很多，高乙醇污水排放不利于环境保护。

上世纪以来公开的右旋糖酐蔗糖酶受体的研究表明，以麦芽糖、异麦芽糖、异麦芽糖、果糖、葡萄糖等小分子为受体的研究发现，受体在右旋糖酐蔗糖酶作用下从蔗糖接受葡萄糖基合成低聚糖，抑制大分子右旋糖酐的合成。其中异麦芽糖和麦芽糖是强受体，合成低聚糖最多，右旋糖酐最少。但受体浓度过高，合成低聚糖分子量小，受体浓度低，则仍以合成大分子右旋糖酐为主。

有研究表明，用右旋糖酐酶可以把右旋糖酐T20或T40，水解得到重均分子量5000Da左右微分子右旋糖酐。因为两种右旋糖酐分子量相近且分布集中，因此目标右旋糖酐得率较高。但该方法采用的是纯化好的商品右旋糖酐，成本高，且适用于水解得到重均分子量10000Da以下的右旋糖酐。

由于膜过滤时，水分透过比例远大于糖酐，膜过滤的级数越多，需要加入的水越多，糖酐分离的效率越低。不仅影响右旋糖酐的收率，也影响果糖的回收利用。要提高膜分离效率和右旋糖酐收率，把膜过滤回收目的右旋糖酐的级数控制在两级，要求目的糖酐集中在某一个区间，最好分子量重复可控。采用酶水解或酸水解的工艺，均难以达到。