[发明专利]基于CRISPR/Cas12a-RPA快速检测水稻白叶枯病菌的序列组合及其应用

权利要求书

1.一种基于CRISPR/Cas12a-RPA快速检测水稻白叶枯病菌的序列组合，包括根据GSFP基因设计的RPA引物序列、crRNA序列，其特征在于，

RPA引物序列为：

正向引物RPA-GSFP-F1为：5’-TTGGCTAATGACATGGAAATGGTTCCCGTG-3’，

反向引物RPA-GSFP-R1为：5’-AATTCAAGCTCCGATGCGAAATAGGCACGC-3’，

crRNA序列为：UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUACUGUAGACAUCGCAGAUCAACA。

2.根据权利要求1所述的一种基于CRISPR/Cas12a-RPA快速检测水稻白叶枯病菌的序列组合，其特征在于，还包括ssDNA探针序列，所述ssDNA探针序列包括用于可视化荧光检测的水稻白叶枯病菌的ssDNA探针序列或用于侧流层析试纸条检测的水稻白叶枯病菌的ssDNA探针序列。

3.根据权利要求2所述的一种基于CRISPR/Cas12a-RPA快速检测水稻白叶枯病菌的序列组合，其特征在于，

用于可视化荧光检测的水稻白叶枯病菌的ssDNA探针序列为：ssDNA-reporter-FAM-2为：5’-6’FAM-TGTCTTATcccccATAAGACA-BHQ1-3’；

用于侧流层析试纸条检测的水稻白叶枯病菌的ssDNA探针序列为：FB-reporter为：5’-6’FAM-TTTTTTTTT-Biotin-3’。

4.一种快速检测水稻白叶枯病菌的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1-3任一项所述的RPA引物序列、crRNA序列以及Rehydration Buffer，MgOAC、冻干酶粉、Cas12a酶、ddH₂O。

5.根据权利要求4所述的一种快速检测水稻白叶枯病菌的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有多个独立单元的八连排PCR反应管，所述PCR反应管中含有冻干酶粉；所述试剂盒分为两个反应体系，包括用于进行RPA反应的反应体系和用于进行CRISPR/Cas12a的反应体系。

6.根据权利要求5所述的一种快速检测水稻白叶枯病菌的检测试剂盒，其特征在于，用于进行RPA反应的反应体系工作时，总体积50μL的反应体系为：2.4 μL浓度为10 μM的正向引物RPA-GSFP-F1、2.4 μL浓度为10 μM的反向引物RPA-GSFP-R1、29.5μL Rehydrationbuffer、11.2 μL ddH₂O、2 μL模板DNA，混匀后迅速放入含有冻干酶粉的反应小管中，将冻干酶粉溶解后，最后加入2.5 μL的MgOAC；用于进行CRISPR/Cas12a的反应体系工作时，反应体系选自如下任一种：

总体积为20 μL的反应体系为：2 μL SF缓冲液、1 μL浓度为10 μM 的crRNA序列、1 μLRNA酶活力为40 U/μL的酶抑制剂、2 μL浓度为10 μM的ssDNA-reporter-FAM-2、1 μL浓度为1 μM 的LbCas12a、2 μL RPA反应产物，11 μL DEPC处理水；

或总体积为20 μL的反应体系为：2 μL SF缓冲液、1 μL浓度为10 μM的crRNA、1 μL 酶活力为40 U/μL的RNA酶抑制剂、2.5 μL浓度为100 nm的FB-reporter、1 μL浓度为1 μM的LbCas12a、2 μL RPA产物，10.5 μL DEPC处理水。

7.权利要求4-6所述的一种快速检测水稻白叶枯病菌的检测试剂盒在检测田间水稻白叶枯病菌中的应用。