[发明专利]基于CRISPR/Cas12a-RPA快速检测水稻白叶枯病菌的序列组合及其应用

说明书

本发明提供基于CRISPR/Cas12a‑RPA快速检测水稻白叶枯病菌的序列组合及其应用，属于病原微生物检测技术领域。本发明提供了一种检测水稻白叶枯病菌的RPA引物对、特异性crRNA。本发明还提供了一种基于CRISPR/Cas12a‑RPA快速检测水稻白叶枯病菌的试剂盒和方法。本发明的检测方法将RPA扩增方法与CRISPR/Cas12a的检测方法结合来检测水稻白叶枯病菌，通过蓝光切胶仪和侧流层析试纸条实现可视化检测。该核酸检测方法简单快速，具有良好的特异性和敏感性，只需要简单的恒温加热器便可以进行检测，具有现场和田间快速核酸检测的优势。

技术领域

本发明涉及病原微生物检测技术领域，尤其涉及一种基于CRISPR/Cas12a-RPA快速检测水稻白叶枯病的方法和试剂盒。

背景技术

水稻白叶枯病是一种由水稻黄单胞菌引起的细菌性病害，这种病害严重破坏水稻产量。水稻白叶枯病在各大洲中（除欧洲外）均有报道，在极端情况下，每年有数百万公顷的水稻受到影响，损失可高达75%。在出现明显的症状之前，早期感染水稻白叶枯病的水稻，难以通过非专业知识进行物理诊断，导致水稻白叶枯病的爆发引起水稻作物的大量死亡。因此，通过分子技术在水稻种子带菌阶段或者在水稻幼苗期检测到这两种病害，对于水稻的生产，农民的增收有着重要的意义。

目前，检测水稻白叶枯病的方法主要是传统的检测方法和近些年发展的分子检测技术等。传统的检测方法主要有噬菌体检测法、育苗生长观察法、致病性测定、直接分离法、血清学检测技术等；近些年发展的分子检测技术主要有：普通PCR、数字PCR、荧光定量PCR法等。传统的检测方法耗时长，检测不方便，并且需要专门的技术人员进行检测，并且像噬菌体检测法具有专化性，容易造成假阴性，血清学检测技术容易造成假阳性。近年发展的分子生物技术如PCR技术、荧光定量PCR技术需要依靠专业的人员、昂贵的实验仪器、特定的实验场地，并且耗时长，检测不方便；目前，我国检测水稻白叶枯病的国家标准是基于含铁细胞接受因子基因利用PCR技术来检测。

CRISPR/Cas（簇状规则间隔短回文重复序列/CRISPR相关）是细菌和古细菌等原核生物中一种自然发生的适应性免疫系统，随着不断发现具有不同活性的Cas蛋白，CRISPR/Cas系统已被广泛应用于各种传染性微生物（包括病毒和细菌）的诊断。此外，该系统还可用于检测microRNAs（miRNAs）、单核苷酸多态性（SNPs）和DNA甲基化等方面。II类CRISPR蛋白中的Cas12a酶，除了具有特异性靶向外，还表现出对邻近核酸非特异性切割的能力，已经结合等温扩增技术广泛应用于各种微生物的诊断。由于其特异性强、灵敏度高、方便快速，使得该方法可以在田间进行水稻白叶枯病的快速检测和诊断。

发明内容

针对上述问题，本发明提供一种基于CRISPR/Cas12a技术结合RPA技术快速检测水稻白叶枯病菌的方法和试剂盒，具有特异性好、灵敏度高、简单快速、样本要求低、高效等特点，可以实现在田间快速检测的要求，提高检测效率，可为水稻白叶枯病菌的检测方法提供一种新的选择。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：一种基于CRISPR/Cas12a-RPA快速检测水稻白叶枯病菌的序列组合，包括根据GSFP基因设计的RPA引物序列、crRNA序列、ssDNA探针序列，其中，

RPA引物序列为：

正向引物RPA-GSFP-F1为：5’-TTGGCTAATGACATGGAAATGGTTCCCGTG-3’，（SEQNo.1）,

反向引物RPA-GSFP-R1为：5’-AATTCAAGCTCCGATGCGAAATAGGCACGC-3’，（SEQNo.2）,

crRNA序列为：UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUACUGUAGACAUCGCAGAUCAACA,（SEQ No.3），

ssDNA探针序列包括用于荧光定量PCR仪器检测的水稻白叶枯病菌的ssDNA探针序列、用于可视化荧光检测的水稻白叶枯病菌的ssDNA探针序列、用于侧流层析试纸条检测的水稻白叶枯病菌的ssDNA探针序列中的任一种。