[其他]用细菌培养生产透明质酸

说明书

透明质酸是从生物中提取的一种粘多糖体。已发现其在缓冲生理盐水中钠盐即透明质酸钠，在眼科手术及其他医学应用中可作为玻璃体的替代物有重要用途。在美国专利4141，973及4，328，803中已描述了一些在这方面的应用。为了这类医学上的目的，到目前为止曾经使用了分子量超过75万的无热原高纯度透明质酸钠。由新泽西州Piscataway的Pharmacia公司生产的名为“海龙（Healon）”的商品是为这类目的而出售的透明质酸钠的1%溶液。例如，据报道烯海龙液（含0.1-0.2%的透明质酸钠）眼药水。作为治疗干性角膜炎综合症很有用。透明质酸还用于试管培养麻疯杆菌作为配料及用作化妆品配方中的一种成份，这在美国专利4，303，676中说明的配方中既包括低分子量组份（约10～5万）又包括较高的分子量组份（超过1百万）。所有上述用途的透明质酸的来源为公鸡之冠，人的脐带或其他脊椎动物的组织。从这类组织中提取并提纯的透明质酸价格非常昂贵。用链球菌的A组和C组菌株能够生产透明质酸。曾经报道的作为细菌产品的一种用途是在人的血清中测定抗链球菌的透明质酸酶时作为试剂的，参见Kjems及Lebech在斯堪纳维亚病理学微生物学学报B部分84：162-164（1976）一文。在该论文中作者叙述了培养A组链球菌的限定配方的培养基，报道的产量为每公升培养肉汤中可分离出透明质酸0.3克。然而用细菌生产的透明质酸还未发现有实质上的用途，因为该酸属于低分子量范围。

本发明提供的用细菌源生产的透明质酸，其分子量范围比在先有技术中已报道过的用细菌源生产出的透明质酸的分子量范围更高。本发明提供的方法，其产量也比以前报道过的大大提高。该方法另外还生产医用的、纯度可与现有的相比拟或更好的透明质酸。虽然在典型情况下用本方法生产的透明质酸具有的平均分子量约为五万五千，但作为眼药水的成份及化妆品配方的成份，它有潜在的重要用途。用本发明的方法生产的透明质酸产量高、纯度高、成本低，因而可用于以前没有叙述过的地方，或是用哺乳类动物源或低产量的细菌源所生产的透明质酸未曾打算用的地方。例如透明质酸可以在食品加工中用作致湿剂，其他应用方面，有作为润滑剂，及在外科手术后用来减少由于纤维化反应及/或粘连形成所引起的并发症。该材料还可以用于回收第三纪原油时作为聚丙烯酰胺的代用品，类似的合成聚合物或从生物中生产出的聚合物。

本发明的方法的最佳形式包括在无氧条件下在二氧化碳富集的生长培养基（其中包括用细菌生产透明质酸所需的那些原料）中培养出可生产透明质酸的链球菌菌种。虽然不是必需杀死细菌但最好杀死细菌，将细菌与生长培养基分离，在离析出透明质酸。最好在肉汤培养基分离，再离析出透明质酸。最好在肉汤培养基中发酵使细菌生长。其他生长技术及培养基都可以使用。例如可以用琼脂培养基。所以“生长培养基”一词在此可以广义地指液体或固体培养基或两者的组合，且发酵之外的其其他生长方式，在技术上是众所周知的。

虽然本发明的最佳方式是设想在可产生透明质酸的培养基中直接生长细菌，但也可以在其他生长培养基中生长细菌，将细菌与培养基分离，在缓冲悬浮液或蒸馏水中再悬浮细菌，并在悬浮液中加适当的原料以便用已经生长细菌生产透明质酸。这种被看作为与最佳方法相同的工艺仅包括使用静止的细胞悬浮液。因而此处“使培养物生长”等词都应当作是包括在其范围中的两种手段。

与以前透明质酸的生产方式不同，在接种前可以通过1万（10K）额定分子量限制截止过滤器如微孔聚胺膜盒式切向流过滤系统来滤掉所有成份，从一开始就将内毒素从系统中排出，其后维持无热无氧的生长条件。

在本发明的最佳实施例中，使用了诸如含有以下成份的半限定生长培养基：

1.酪蛋白水解液，酶催性    20.0克

2.氯化钾    3.0克

3.磷酸钠，二代性    2.8克

4.硫酸镁（7H₂O） 0.5克

5.氯化钙（2H₂O） 10.0毫克

6.葡萄糖    20.0毫克

7.维生素溶液

A）D-生物素    2.0毫克

B）D-泛酸钙    1.0毫克

C）氯化胆碱    1.0毫克

D）叶酸    1.0毫克

E）I-肌醇    2.0毫克

F）烟酰胺    1.0毫克

G）盐酸吡哆醛    1.0毫克

H）核黄素    0.1毫克

I）盐酸硫胺素    1.0毫克