[其他]多核苷酸探针

说明书

本发明涉及用于探查人类或动物基因组的可标记的多核苷酸探针，以及用该探针定基因组DNA的方法。这些定法在父系和母系检验、法医学、遗传疾病以及癌症的诊断方面是有用的。

以前定基因组DNA中遗传变异的主要方法是检测限制性片段长度多态性（RFLP）。如定引起Huntington氏午蹈病DNA缺陷的部位（见J.F.Gusella等，Nature 306，234-238，1983）;以及对成视网膜细胞瘤的前因素的分析（见W.K.Cavanee等，Nature 305，779-784，1983）。

大多数RFLP是由于DNA中小范围改变，通常是由于硷基置换引起的，造成或破坏了特异限制性内切酶位点所致。因为人类DNA的平均杂合性较低（每个碱基对大约0.001），故在一个已给定的部位很少能由限制性内切酶确定一个PFLP。即使进行了此项测定，由于大多数RFLP就杂合性来说只是二态性的（有或没有限制性核酸内切酶位点），其所取决的等位频度也绝大超过50%，而通常还要低些，因此不管考查的个体是否为纯合子，所有这些RFLP对于谱系分析均没有意义（不能提供所需要的信息）。

对于表现出多等位基因变异，而具有高杂合性的DNA，如得到该高变异区域的探针，则可大大简化其遗传分析程序。第一个这样的区域是由A.R.Wyman等人由人DNA的随机片段文库中得到的（见Proc.Nat.Acad.Sci.USA    77，67546758，1980）。在这个区域上多等位基因变异的结构基础尚不明了。继之，也是出于偶然，在靠近人胰岛素基因处（G.I.Bell等，Nature    295，31-35，1982），和靠近β-珠蛋白基因处（N.J.Proudfood等，Cell    31，553-563，1982;S，E，Y.Goodbourn等，Proc.Nat.Acad.Sei.USA    80，5022-5026，1983）;以及在靠近C-Ha-ras-l致癌基因处（D，J.Capon等，Nature    302，33-37，1983）又发现了其它几个高可变区。在这种情况下，可变区均包括短序列〔“微小随体（minisatellite）〕的串联重复。多态性起因于等位基因在重复数目上的差异，可能是由有丝分裂或有丝分裂的不均等交换或由复制期间DNA滑动所引起的。可使用任何不裂解重复单位的限制性内切酶确定所得微小随体长度的变异。

本发明人及同事先前曾描述了一种人肌红蛋白基因内含子中的，由四个33bp序列串联重复组成的短的微小随体（见P.Weller等，EMBO    J.3，439-446，1984）。值得注意的是，33bp重复序列上表现出与前述其它人类微小随体有“微弱的”相似性。该文推测，微小随体区域可能是因转位而出现的。如果人肌红蛋白基因中33bp重复是可转位的，则其可能提供一个人基因组的串联重复区域的探针，该基因组常常与重复数目不同而导致的多等位基团多态性有关。

用肌红蛋白基团中33bp的串联重复序列DNA探针探查人类基因组DNA。在3个个体（父，母和女儿）的基因组DNA中的几个不同区域观察到了多态变异。这种变异出现于较大的片段中（2-6Kb），与一个以上微小随体区域的长度变异所致的稳定遗传之多态性相对应。

进一步的研究揭示，为了显现微小随体或高可变区中的变异性，用以下方法探查基因组DNA，比用肌红蛋白基因33bp重复片段探针更为有效。

本发明是基于以下发现：即人类或动物基因组DNA中许多微小随体含有一个DNA区域，该区域在不同微小随体间具有高度均一性。此共同核心区为长约16碱基对的短序列。现已发现，以串联重复的核心核苷酸序列作为其基本成分的探针，至少须重复三次才可用于测定基因组DNA中的各种不同微小随体区，并且有能参照这些区域DNA的变异，对个体样品作出定或作出指纹图谱的精确程度。所得结果之好，完全超出预测，因为以前制得的探针只是能检定基因组DNA中的单一微小随体区。这些探针的别程序要比由RFLP所给出的好，但却不能提供就个体而言实质上是唯一的指纹。值得指出的是，本文所提出的核心探针能够根据一个以上的微小随体区域或高可变区来区分DNA，正是这一发现，导致了一个不易察觉的且又并非一般水平的发明活动，而使本发明具有基础科学的新颖性和重要性。