[其他]促生长素的溶解和复性方法

说明书

重组DNA技术已使异源蛋白质能在一些宿主细胞如大肠杆菌（E.CoLi）中得以表达，但已有报道指出，有些异源蛋白质，如促生长素，往往在表达后仍不同程度地被封闭于宿主细胞的胞质折射体内。

一些促溶剂，如盐酸胍、硫氰化钠、尿素和不同的去污剂，已被用来破坏蛋白质分子内的非共价联系。例如已有实验表明，在促溶剂的作用下，蛋白即“展开”，见Stryer，Biochemistry，《生物化学》（1981年第二版）34-35页，W.H.Freeman和Cempany。同样地，促溶剂还能使多亚基蛋白质解离，形成其各个亚基。

最近欧洲专利申请114，506A号公布，异源蛋白质能用某种烈性促溶剂如盐酸胍、去污剂如十二烷基硫酸钠和硫氰酸盐从折射体内溶解出来。而尿素这种较弱的促溶剂则对折射体无溶解作用。但盐酸胍这样的强变性剂是很昂贵的。此外，异源蛋白质一经溶于强变性剂，还必须把它移入不会干扰以后的离子交换纯化步骤的弱变性剂中。

因此，本发明的目的是提供一能从宿主细胞的折射体中溶解出异源促生长素蛋白，并使其复性的改良方法。

提供应用既容易得到，又相对便宜的试剂的方法，是本发明的目的之一。

在相当高的促生长素浓度下进行复性也是本发明的一个目的。

使促生长素蛋白的溶解和/或复性在有或无还原剂存在的情况下都能进行则是本发明的另一目的。

另外，采用一种在生态学意义上较以往所用试剂更为安全的试剂也是本发明的目的。

本发明的所有这些目的和优越性对于那些熟悉以下叙述和例证的人来说将是显而易见的。

简言之，本发明提供了一种从宿主细胞的折射体内溶解出促生长素蛋白并使之复性的方法。特别是本方法还包括这样一个发现，即观察到一种尿素或二甲砜的水溶液能用来有效地溶解含有促生长素这类蛋白质的折射体。令人惊奇的是，还进一步发现促生长素蛋白一经溶解，在尿素或二甲砜的溶液中与温和氧化剂接触的时间足以使蛋白质天然构象中的二硫键得以形成，促生长素蛋白即可复性。同时，这种复性过程即使在高蛋白浓度，制品不纯甚至不用还原剂的情况下都能高效率地发生。

为了说明本发明的目的，似乎应考虑对一些术语作如下定义：

“促生长素”指包括但并不只限于哺乳动物的促生长素，如人、羊、猪和牛的促生长素，和鸟类的促生长素。除了适用于上述具有天然顺序的蛋白质外，本发明同样适用于一系列与天然存在的蛋白有关，且具有促生长素样活性的类似物和同源物。对本方面熟悉的人们将明白其它具有促生长素相似化学性质的促生长素类的蛋白，如催乳素和胎盘催乳素，从纯化上考虑实际上是与促生长素等同的。有鉴于此本发明亦包括这样一些蛋白质。

“异源”蛋白质是指宿主细胞正常情况下不产生的蛋白质。重组DNA技术已使大量异源蛋白质在转化的宿主细胞中得到表达，但尚不十分了解的是，这些蛋白质常会被隔离在宿主细胞胞质的不溶性光折射体中。

“折射体”指这样的包含体或胞质内凝聚物，它们，至少其中一部分，含有被提取的异源促生长素。这些凝聚物在相差显微镜下看上去象一些明亮的斑点。

“宿主细胞”指一种微生物细胞，如细菌和酵母或其他适宜的细胞，如动、植物细胞，它们已被转化用以表达异源促生长素。宿主细胞在本发明中被看作是那些表达了外源促生长素然后将此激素封闭进折射体的细胞。一种典型的宿主细胞是大肠杆菌（E.CoLi）K₁₂（W3110/PBGH-1株），该细胞已被转化来表达牛促生长素。

“复性”是指促生长素蛋白折迭和氧化形成具有其生物活性的天然构型。

“折迭”是指蛋白质整体构型的恢复足以使之适当的氧化。折迭是通过降低尿素的变性效应来完成的，如有必要，将尿素浓度调节到一适当水平，从而保证蛋白质中氨基酸的相互作用以呈现其二、三级结构。

“氧化”是指分子内二硫键的形成，以获得稳定的天然构型，从而保证其生物活性。

“温和氧化剂”指一种促使巯基氧化，使其形成分子内二硫键，但不氧化蛋白中其它取代基团的试剂。在采用温和氧化剂如过氧化氢的同时，暴露于空气的方法也是完全可接受的并且更为可取。

“生物活性”是指促生长素能够产生其应产生的体内生理反应。此生物活性能通过已去除内源性促生长素的特定物种的适宜的体内生物测定实验来鉴定。本发明采用一种适用的促生长素生物测定法，称之为“大鼠增重生物测定法”。该方法中，促生长素制品的生物活力是相对一已知制品（如提取的天然促生长素）来估价的。系通过比较不同的制品剂量与对去垂体大鼠体重的增长量的关系来确定。