[其他]从产生蛋白质的培养基中提取和净化蛋白质的方法

说明书

本发明叙述了从产生蛋白质的培养基中提取和净化蛋白质的一种改进的方法，更确切地说，本发明讲述了，在采用重组脱氧核糖核酸技术从受控细胞培养物中，或更确切地说，从受控酵母菌株培养物中产生肝炎B病毒表面抗原和α-1-抗胰蛋白酶时，如何提取和净化肝炎B病毒抗原和α-1-抗胰蛋白酶的方法。

在各种微生物中，细菌和酵母可被用作含有一个脱氧核糖核酸分子的不同质体的寄主生物，这种分子包含一种特定蛋白质的核苷酸顺序编码。在这些微生物中，酵母是目前最好的和通用的。例如，欧洲专利申请说明书0106828号公开了使用酿酒酵母生产肝炎B病毒表面抗原（HBsAg）的方法，欧洲专利申请说明书0103409号也叙述了用酵母质体生产α-1-抗胰蛋白酶的方法。

用酵母菌株中生产蛋白质比用细菌菌株中生产蛋白质具有更多的优点。这些优点来自以下二方面，第一，酵母在大规模发酵器中较易生长，第二，酵母在新合成的蛋白质上增加碳水化合物基团的能力和哺乳动物细胞相似，而细菌则没有这种能力。

由于酵母细胞的化学成分相当复杂，特别是为了改进多肽的生产率而延长酵母生长期，结果使脂质含量增高时，从酵母培养物提取和净化蛋白质就出现了一些技术问题。

例如，酵母属细胞壁被认为由三层组成：（a）不溶于碱的β-葡聚糖内层，（b）可溶于碱的β-葡聚糖中层和（c）糖蛋白外层，其中碳水化合物含有磷酸化的甘露聚糖;细胞壁下面是一层细胞质膜，此膜系由中性脂质（单一、二、和三甘油酯）、游离的和酯化的甾醇、一种复杂的神经鞘脂类、甘油磷脂以及中性的和酸性的糖脂等组成的一种非常复杂的混合物;核含有脱氧核糖核酸、各种核糖核酸和一种多聚磷酸盐;空泡含有许多高分子量和低分子量的成分，他们是作为许多水解酶的贮存泡;线粒体富含脂质、磷脂和膜系统的麦角甾醇成分;细胞质则含有大量的核蛋白体、多聚磷酸盐、糖原和许多糖酵解酶。大多数酵母细胞（例如酵母属菌株）也含有一些小球形的脂质，延长培养期，其量会增加。

已经公开了一些用于提取和净化不同来源的蛋白质的多步骤工艺程序。例如关于从受控微生物产生蛋白质的出版物有以下一些：斯塔海伦（Th.Staehelin）等人（J.Biol.Chem.256;9750-54;1981），默里（K.Murray）等人（The    EMBO    J.3;P.645-650;1984）和希茨曼（R.A.Hitzeman）等人（Nucl.Ac.Res.11;2745-2763;1983）的文章。

典型的是，当产生的蛋白质与细胞结合时，那些不同的方法包含三个步骤系列。

在第一步骤系列中，所需要的蛋白质是从细胞内部脱除。因此，细胞或者被溶解（例如通过酶处理）或者被破碎（例如通过剪切力那样的机械力，例如X-压力机或法国压力机）或同玻璃珠一起摇动，最后加入一种洗涤剂（见默里等人以及希茨曼等人在上述参考文献中所述）。

在第二步骤系列中，培养基在所需要的蛋白质中富集，例如通过加入硫酸铵和（或）在聚乙二醇存在下进行分段沉淀。

最后，在第三步骤系列中，实际上全部污染物都从培养基中被去除，例如，采用下述一种或几种方法，这些方法包括超滤、离子交换、凝胶过滤色谱和等密度梯度离心分离。

在这一工艺程序中，显然，随同蛋白质（希茨曼等人所述，在上述引文中）、核酸和脂质，更准确地说高的脂质含量等污染物，对第三系列步骤中的至少一步骤（例如超滤和柱色谱法）具有有害的影响，而且蛋白酶必须从培养基中快速除去。此外，由于脂质会干扰沉淀，因此如不预先进行粗脱脂，则用硫酸铵沉淀是不可能的。

因此，最重要的是安排一种方法，该方法可以在第三步骤系列前消除大部分污染物。

在某些上述方法中，使用了聚乙二醇作为蛋白质的选择性沉淀剂，还有报告提及用脂蛋白-多阴离子-金属相互作用以从血浆中沉淀脂蛋白的方法。

波尔森（Polson）等人（Biochem.Biophys.Acta    82;463-475;1964）曾提出使用可溶于非离子水的聚合物，更明确的说是聚乙二醇（PEG）、来分段沉淀蛋白质的方法，并由不同的作者进行了讨论。其中霍尼格（W.Honig）等人（Analyt.Biochem.72;502-512;1976）提及“通过使用比通常应用的聚乙二醇6000平均分子量更低的聚乙二醇组分可以改进沉淀的专一性，即所需要的蛋白质和总蛋白质的比例”。然而，作者又讲，“虽然通过控制pH，可以得到某种血浆蛋白质的浓缩物，但是，对更复杂的蛋白质混合物，例如细胞匀浆的上层清液来讲，净化的效果是相当差的”。