[其他]抗血友病因子纯化方法

说明书

鉴于本发明得到美国卫生和保健部Rol    HL29688号和RR    053-99号拨款资助，美国政府对本发明享有权利。

本发明与蛋白纯化方法有关。更具体地说，本发明与糖、多元醇、氨基酸或盐的存在下，采用柱层析技术纯化抗血友病因子Ⅷ：C（以下简称AHF）的高回收率和高分辨率的方法有关。用此法制备的AHF纯度高。

凝血促进剂蛋白因子Ⅷ（AHF）是一种在血友病病人血浆中具有纠正凝固缺陷的一种血浆蛋白。事实上，AHF活性是以在血友病A血浆中其诱导凝固的能力来测量的。

一个单位AHF是指1毫升的正常男性成人血浆中所存在的AHF量。本文所采用的标准，即世界卫生组织标准，可以从英国伦敦汉普斯特（Hampstead），好莱.希尔（Holly    Hill）的国立生物学标准和质量控制研究所得到。

AHF在临床治疗方面的主要应用一直是给血友病病人做静脉注射。起初，这种应用包括全血和新鲜的冷冻血浆做静脉滴注，这种方法需要长时间的滴注，而且常常会引起血容量过多。

血浆冷沉淀物（“Cryo”）的应用仍然需要很长的滴注时间。这种Cryo不能完全溶于滴注所用的溶剂中，因而需要过滤。它所含的AHF量低，且波动大。滴注所需要的Cryo体积大，而且在使用前为了解AHF含量而检查多层封闭的灭菌容器这一步骤是相当繁锁的，且常常被忽略。因此，治疗可得到的Cryo正确量可能是不确切的。而且，需要将Cryo装在大的塑料储血袋中，贮于-20℃，所以还需要有大型的冷冻设备。有鉴于此，这种原始方法不可能应用于家庭治疗。

冷冻干燥的AHF浓缩物的应用解决了上面提及的许多问题。这种浓缩物一般可用下法制得：先将血浆作冷沉淀处理，然后用聚乙二醇作第二次沉淀。该浓缩物在冷冻条件下是稳定的，它们可以完全溶于重新溶解用的液体中，并可重新溶解于比Cryo更小的体积（10-30ml）中，因而可检出的AHF浓度比存在于血浆中的高10-30倍。

遗憾的是，用这个方法获得的产率（该产品中的AHF活性/原血浆中的AHF活性）只有约20%，这就使得该因子的生产成本高。此外，其所需要的滴注体积仍较大（30ml/1000单位AHF），这就又产生了贮存问题，并使家庭治疗难于开展，其结果是治疗费用增加。

而且，这些浓缩物中含有少于0.1%的AHF蛋白和99.9%的杂蛋白，其中包括（1）能够引起溶血的特异的血型抗体;（2）可以引起T细胞比率（辅助/抑制）倒置在内的免疫异常的蛋白，这种蛋白类似爱滋病（AIDS），纤维蛋白元纤维结合素、维勒布兰德因子（遗传性假血友病因子）和其它蛋白。冷冻干燥的浓缩物常常受病毒（如乙型肝炎病毒，非甲非乙病毒，可能还有引起爱滋病的病毒）污染。将这些制品在液体状态作加热处理可以破坏大多数的微生物，但同时也会引起AHF的有活性的组分的变性。

层析技术（离子交换层析法和疏水层析法）一直在应用着，但仅限于实验室应用。用这种技术所得到的产率一直是低的（最大30～40%），且分辨率极差。

显然，需要一种低成本和高产率的AHF制剂纯化技术。

满足这种要求的尝试包括用单克隆抗体进行的免疫亲和层析的应用。Zimmerman等报道了，带有异种沉淀抗体的人凝血促进剂蛋白因子Ⅷ的鉴定[Proc.Natl.Acad.Sci.（U.S.A）79∶1648（1982）和美国专利号4，361，509（1982年11月30日颁发）]。虽然这些文献报告可从血浆获得纯化164，000倍的AHF，但整个操作包括6个步骤，且在没有加热这一步骤的条件下，全部回收率约为12%。J.J.Morgenthaler报道抗血友病因子可在二氨基烷和氨基烷衍生的琼脂糖凝胶上层析分离[Thromb.Hamoslas（stuttart）47（2）∶124（1982）]。在这篇文章里，作者透露把醋酸-赖氨酸缓冲液应用于改良的琼脂糖凝胶柱上，以从聚乙二醇沉淀的AHF纯化抗血友病因子Ⅷ∶C，作者指出，是疏水力，不是离子力支配这些层析柱的性能，但这篇文献没有提及产品的产率和纯度。