[发明专利]蛋白质的生产

说明书

本发明涉及到生产蛋白质的方法。

各种生理活性蛋白质，象细胞素和肽类激素的存在已被证明，遗传工程技术上的最新进展已使得能够大规模生产这些生理活性蛋白质及将其用于临床。

白细胞介素-2〔下文中简写成IL-2;也叫T细胞生长因子（TCGF）〕是一种通过尤其是外源凝集素或异抗原刺激T细胞而产生的淋巴因子〔Science，193，1007（1976）〕。

利用IL-2，到目前为止已经获得了大量的杀伤T细胞或辅助T细胞以及天然杀伤细胞的无性系（例如Nature，268，154（1977）〕。除直接用于无性繁殖T细胞或天然杀伤细胞外，应用IL-2可导致在体外选择性增殖能识别并摧毁某种特定抗原，例如一种肿瘤抗原的专-抗原杀伤T细胞。将这样生长的肿瘤专一性杀伤T细胞引入动物体内能够控制或抑制肿瘤的生长〔The    Journal    of    Immunology，125，1904（1980）〕。

这些试验的发现表明了IL-2作为一种抗肿瘤剂应用的可能性。进而得知IL-2重建了缺乏thumus功能的裸鼠辅助T细胞功能〔European    Journal    of    Immunology，10，719，（1980）〕并恢复了杀伤T细胞抗同种异体细胞的诱导作用〔Nature，284，278（1980）〕，因此，IL-2有希望用于治疗免疫缺陷症。

干扰素-α〔下文简称IFN-α〕和干扰素-γ（下文简写为IEN-γ）是病毒或核酸激活的淋巴细胞产生的淋巴因子，它们具有作用于细胞并使之进入抗病毒状态的生物学活性，并因此在防御系统或肿瘤免疫系统中起重要作用。

象细胞素这样一类的蛋白质可象天然产生的一样获得，但数量非常有限。然而，重组DNA技术的最新成果已经开创了从大菌杆菌等的培养菌株中回收生物活性蛋白质的方法，这些菌株中分别携有上述蛋白质基因的表达载体〔对IL-2：Nature，302，305（1983）和Nucleic    Acids    Research，11，4307（1983）;对IFN-α，Journal    of    Interferon    Research    1，381（1981）;对IFN-γ：Nature，295，503（1982）〕。

因为无论是在真核生物或原核生物中，蛋白质的生物合成起始于表达蛋氨酸的信使RNA密码子AUG，所以产物蛋白质可能是一种在N末端有蛋氨酸残基的分子或没有该残基的分子甚或两种分子的混合物。事实上已知在大肠杆菌中，许多细胞蛋白质的末端是蛋氨酸〔Conn    &    Stumpf：Outlines    of    Biochemistry，4th    edition，John    Wiley    &    Sous（1976）〕而且大肠杆菌的起始因子IF-3就含有N末端有蛋氨酸残基的分子和没有该残基的分子〔Hoppe-Seyler′s    Zeitschrift    für    Physiologische    Chemie，354，1415（1973）〕。说到用重组DNA技术在大肠杆菌中产生的蛋白质，已知对于IFN-α加入于N末端的蛋氨酸残基百分比大约是50%〔Journal    of    Interferon    Research，1，381（1981）〕，而对于人生长激素则高达100%〔Nature，293，408（1981）〕。然而到目前为止，还没有在这些蛋白质中蛋氨酸残基加入百分比控制实例的报道。在他们的用植入了IL-2基因的大肠杆菌菌株生产IL-2蛋白质的方法的研究过程中;本发明者发现大肠杆菌产生的IL-2蛋白是由两种分子构成的，即N末端没有蛋氨酸残基的IL-2，这是一种以丙氨酸残基作为N末端氨基酸〔Ala-IL-2〕起始的分子，以及在N末端加入有蛋氨酸残基并因此以蛋氨酸丙氨酸残基〔Met-Ala-IL-2〕起始的分子，后者的含量比前者高得多。

类似的有，已发现大肠杆菌产生的IFN-α和IFN-γ的每一种都是N末端以半胱氨酸起始的分子〔分别为Cys-IFN-α和Cys-IFN-γ〕与N末端加入有蛋氨酸残基并因此以蛋氨酰半胱氨酸残基〔分别为Met-Cys-IFN-α和Met-Cys-IFN-γ〕起始的分子的混合物，后者占5-50%。

这些N末端具有蛋氨酸残基的蛋白质应该具有与天然类型的相应蛋白质相似的生物学活性，但无论如何是与后者不同的物质。因此，已知的方法在生产具有天然类型各自氨基酸序列的蛋白质方面不能完全令人满意。