[其他]以亲和力层析法纯化血红素及改良血红素

说明书

本发明系关于血红素基无细胞递氧体（hemoglobin-based    acellular    oxygen    carriers），尤其系一种藉亲和力层析法技术纯化血红素及改良的血红素。

研究于发展无细胞递氧溶液以应用为一血液取代注重两方面，即血红素基之溶液及过氟碳物质（perfluorocarbon    substances）如在必罗（Biro）之例子说明（Can.Med.Assoc.J，Vol.129，1983，Pp.237-244）。目前的工作已指示，过氟碳类为较不适合，原因是，例如，特别的临床条件为其应用上之需要及毒性问题。因此，现在的研究系集焦于潜在血红素基血液取代。因为血红素于溶液（而非它在自然发现于红血球中）在生理而言并非为满意递氧体，发展具有优良递氧及循环特征之血红素衍生物被委任。

于本研究中血红素之主要来源是目前“落后”输血者“红血球在自然上含有丰富之血红素。从这此来源血红素之隔离藉数种方法而已达成，该等方法为牵涉从其他红血球细胞蛋白质及从细胞基质（cell    stroma）之血红素分离方法。

纯化血红素之标准技术为离子交换层析法（ion-exchange    chromatography）。此技术已经很广泛的被用于分析（analytical）及诊断（diagnostic）应用（例如，参考Benesch    and    Benesch;Meth    Enzymol.，Vol.76，PP，174-179，1981;及Hsia    et    al，J.Chromatog.，Vol.303，PP.425-428，1984）。

然而，一种较迅速及特殊之纯化技术为亲和力层析法，它选择上隔离生物分子，藉其对某种分子、原子团、离子、或基称为配合基（ligands）而与生物分子形成复合物之束缚特殊性。一般上，在此技术中，配合基在一层析的凝胶上是制动的，而一含所需分子之溶液经由凝胶而传送。所需之分子是保留在凝胶上，是凭藉其特殊束缚配合基，而同时其他存在于此溶液之成份被洗提。

已得晓，血红素特别的束缚小多元阴离子性分子，尤其是2，3-二磷酸甘油酸盐（2，3-diphosphoglycerate）（DPG）及三磷酸腺苷（adenosine    triphosphate）（ATP），自然的存在于哺乳类红血球（Benesch    and    Benesch    Nature，Vol，221;P.618，1969）。血红素之束缚处位置即束缚进行位置是位于或接近血红素之四聚物结构之中心（Arkone，A.，Nature，Vol.237，P.146，1972）。这些多元阴离子性分子束缚血红素于位置为重要的在于调整氧束缚亲和力，因多元阴离子性分子之束缚异形位阻上影响了血红素之组成进而引起这些和氧束缚亲和力之减少（Benesch    and    Benesch，Biochem，Biophys.Res.Comm.，Vol.26，P.162，1967）相反的，氧束缚于血红素异形位阻上减少了血红素对多元阴离子之亲和力。因此，氧血红素（Oxyhemoglobin）很弱的束缚DPG及ATP。这在奥卡大（Ogata）及麦康尼尔（（Mcconnell）（Ann.N.Y.Acad.Sc.Vol.222，P.56，1973）描述之旋转标记ATP（spin-labelled    ATP）束缚氧血红素及无氧血红素有表示。

较特定的，上述多元阴离子性分子之束缚处是一般上介于血红素之B-血球蛋白（B-glebin）链之间，而可被认为是介于链之间的一“裂缝”。在红血球之自然条件下，这裂缝是由-DPG（于其醛类形式）之分子所占据。当血红素与氧束缚时以形成氧血红素，一结构重组形成而产生DPG由裂缝冒出而它被认为裂缝关闭之有效性。氧的一分子束缚该四聚物的血红素实际上增加其氧亲和力，以束缚至一第二、第三及第四个氧分子。