[发明专利]制备生长激素的控制释放植入物的方法

说明书

本发明涉及一种制备控制释放植入物的方法，该植入物适用于以可控制的持续速率对宿主施用具有生物活性的重组生长激素。更确切地说，本发明涉及一种纯化借助DNA技术生产的牛生长激素和猪生长激素的方法，所说的激素为适于在可控制释放的装置中应用的形式。

生长激素是一类涉及调节蛋白质代谢以及脂肪、碳水化合物和矿物质代谢的蛋白质，它通过下述方式影响机体的代谢过程，即增加细胞的蛋白质合成速率、减少蛋白质的降解以及增加脂肪酸利用的速率和减低体内用于产生能量的碳水化合物的利用速率。

牛生长激素（BGH）和猪生长激素（PGH）是含有191个氨基酸残基的蛋白质。它们在垂体前叶以“前生长激素”形式合成，于其氨基末端附有额外26个氨基酸。在自垂体细胞分泌前，这26个氨基酸残基顺序被切除，产生了成熟的激素。用从垂体中纯化的BGH进行的田间试验表明，施用了激素的奶牛，其牛奶产量增加且饲料向牛奶的转换情况得以改善（Machlin，L.J.，Journal    of    Diary    Science，56∶575-580，1973）。激素的这种潜在经济价值激起了人们以合理成本获取商用数量的BGH的兴趣。用天然PGH进行的田间试验已表明可以增加使用了激素的幼猪的生长速度。

因此，近年来的大量工作集中于用重组DNA技术获得微生物合成的这种具商业价值的激素。本领域众所周知的基因克隆和操作技木已经用于制备能够指导BGH和PGH合成的重组表达载体。例如，已经证明用连接于调控系统的编码BGH的cDNA转化的微生物可生产所需的激素。Keshet等人（Nucleic    Acids    Research，9∶19-30，1981）报道了全长的BGH多肽在大肠杆菌中的克隆和低水平的表达，该BGH多肽与pBR322编码的β-内酰胺酶部分形成融合蛋白。在公开号0103395的欧洲专利申请中描述了几种表达载体的构建，其中包括编码删除了氨基未端可变部分的BGH多肽的载体。业已发现，删除了成熟激素氨基末端可变部分的BGH多肽保持了生物活性，并在所述的表达系统中可比完整激素进行更高程度的表达。

对牛施用BGH和对猪施用PGH迄今仅勉获成功。本领域熟知的给药方式包括口服、鼻腔给药、直肠给药、局部给药以及肠道以外注射等途径。然而，通过上述途径对牛和猪给药并不方便，因为每天将药物应用于一大群动物中的每头动物要耗费大量的财力和时间。

皮下植入物为将重组的BGH和PGH以持续、有效的剂量施用于每头动物提供了另外一种手段。植入体含有一个被一层可通透激素的保护壁包绕的激素贮存体。这种给药系统的优点在于它们提供了能在相当长的一段时间内控制和预计激素向动物释放的速率的方法。遗憾的是，我们发现含有利用重组微生物在发酵培养基中生产的BGH和PGH的长效装置在植入后发生膨胀和部分分解。上述情况使植入物中的激素被释放，反而影响了激素的释放速率。因此，商业上迫切需要一种生产能有效掺入控制释放植入物的形式的重组生长激素的方法。

本发明涉及用于对宿主动物可控性、持续性施用生长激素的改进植入物。该植入物含有生长促进量的动物生长激素的压制组合物组成，其中的生长激素是用重组DNA技术制备的。更确切地说，本发明涉及一种纯化和浓缩以适于在控制释放植入物中应用形式存在的牛生长激素和猪生长激素的方法，其中的生长激素是用重组DNA技术制备的。本发明也公开了一种制备将生长激素施用于动物体内的控制释放植入物的方法。本发明的方法是基于我们发现了将生长激素的含盐量降至其重量的5%以下时可消除以前在将重组生长激素结合到控制释放植入物时所遇到的膨胀问题。与天然生长激素不同，重组产物含有大量的盐，这种盐主要来自回收过程中所用的缓冲液。

除了去除大部分盐份外，本发明还涉及于存在缓冲液盐的情况下制备重组生长激素的方法，所说缓冲液中的盐可使植入物在生理环境中温润时植入物内为7.4的生理pH。本发明这一方面的内容防止了在植入物和其存在的活体环境间pH梯度的进一步变化。这样梯度将导致生长激素的失控释放。

根据本发明的方法，将从发酵培养基的转化微生物中回收的动物生长激素针对具有由碱性pH至生理pH的透析缓冲液透析，直至生长激素中盐的含量少于5%。除了透析以外的其它脱盐方法可用于制备低盐产品，例如：排阻层析法。将制备的低盐生长激素冻干，然后与一种生物可容性聚合物混合，以制备能压制成植入皮下的单位剂量形式的组合物。术语“生理pH”指约为7.4的pH值。

唯一的附图是用于将生长激素控制释放施于动物的圆柱状植入物的截面图。