[其他]利用负股核糖核酸引起植物体细胞的变化

说明书

本发明涉及把重组DNA技术应用于高等植物的遗传转化或基因工程。特别是，涉及通过采用负RNA股引起高等植物体细胞的变化，以便控制植物的基因表达或者获得其他有用的体细胞效应，例如抗病性的方法。

目前人们已经能够在体外组建遗传物质，即DNA的片段，并将这些片段转化到细菌中的质粒中。同时也能够利用克隆了的片段，或在细菌质粒中克隆完整基因，而质粒作为载体可把这些片段或者基因携入其他细胞。已经获得合适的载体可用于遗传上转化各个植物细胞，从这些细胞可以再生出完整未损的植物。有文件表明外源的基因可以稳定地插入植物细胞的基因组内，从而使完整未损，体细胞正常并且具有繁殖能力的植物得以重建。K.A.Barton.等。含有基因工程方法获得的T-DNA的全长考贝的完整烟草植物的更新，以便将T-DNA传递到R₁子代，32细胞1033（1983年4日）。研宄者们报导他们已经能够将完全的外源基因引入植物细胞并在这些植物细胞中获得基因的表达，同时知道并且期望这些细胞能够被再生为完整未损的植物中。欧洲专利申请S.N.84302582.2号，1984年4月16日申请（Kemp）;PCT申请号WO84/02920/和W084/02913，两者都于1984年1月16日申请（Fraley）。一般地说，插入的基因只有构成位于植物系统的合适的基因控制区域时才能在植物中起作用。

目前绝大多数的用于改变植物的基因工程的方法都包括在细胞水平上利用天然植物转化因素Agrobacterium    tumefaciens，对植物细胞进行饰变的过程，而该转化因素具有感染双子叶植物，并将A.tumefaciens的某一部分DNA（称为T-DNA）转移到植物细胞中去的天然能力。已经提出其他的方法，不采用A.tumefaciens，同时用于转化双子叶植物及单子叶植物的个别细胞，尤其是原生质体。目前许多植物种的基因工程技术上的主要障碍是，不能顺利地从愈伤组织培养物或者原主质再生成许多植物种。对于用目前的技术可以再生的那些植物种而言，培养细胞的基因转化的可导致在完整未损或其他正常植物中完全外源基因的表达。对于用目前技术还不能使之再生的植物种而言，一旦这些技术被改进后，便可实现对于这些完整植物种的有规则的遗传转化。

一旦能够用基因工程方法创造一种植物种，接下来的问题便是使植物获得什么样的合理的遗传转化以便使植物按照人们意愿变得更加适于农业或园林应用。应用于植物的基因工程的一个共同的方法是把外源性的蛋白基因导入植物，以使该基因在植物中表达蛋白质，该蛋白可以有一种或者多种的用途，例如抗病性，抗昆虫性，酶促活性，或可用作食物配料等等。

在此叙述的发明提供一种基因工程技术在植物方面的应用的替代方法，以便使植物获得体细胞的有益的变化，该方法不涉及任何外源蛋白表达，取而代之，该方法涉及对于内源蛋白表达的控制或者对于某一蛋白基因或其他DNA或RNA因子的操纵，该DNA或RNA因子是通过外界因素，如疾病因素或感染因素自然导入植物细胞的。

以前已经认识到人工组建的负股RNA将在体内与互补的RNA杂交。这一现象已用于研宄在大肠杆菌中基因表达的有规律的机制。Mizuno等，在大肠杆菌K-12中小的RNA转录本（micRNA）对基因表达的调节作用，10    Proc.Japan    Acad.59.Ser.B，pp.335-338（1983），Mizuno等，调节基因表达的独特机制：由互补RNA转录本（micRNA）引起的转录抑制作用，81    Proc.Natl，Acad.Sci.USA，pp.1966-1970（1984）。

本发明涉及到对植物进行有用的遗传转化的方法，该方法使植物本身获得有用的体细胞变化，而不特别涉及外源蛋白的表达。该方法包括把为负股RNA的转录而构成的DNA顺序导入植物基因组，这种负股RNA基本上是内源的或天然引入的RNA股的目标的互补，其功能需要加以抑制以便防止内源蛋白基因的表达或者防止自然导入的RNA或DNA的作用，如通过某些类型寄生虫或疾病感染所发生的那样。

本发明的一个目的是提供一种用基因工程创造不需要引起外源蛋白的表达而具有有用的体细胞特性的植物的方法。

本发明的另一个目的是提供一种总的控制植物中的内源基因表达的方法。

本发明的其他目的及优点由下面的详细说明来表明。

附图简要说明

图1表示用于作为本发明例子之一的起始材料的质粒POM5    H2的限制内切酶图。

图2为烟草花叶病毒的RNA的图解。