[其他]利用啤酒酵母基因BAR1分泌异种蛋白的方法

说明书

本申请是1985年10月25日提交的流水号为791，305申请的后继申请。

本发明涉及新的DNA结构，该结构至少含有啤酒酵母（Saccharomyces    Cerevisae）BAR1基因的转译信号肽部分以及至少一个与用所述基因转化的宿主细胞无关的结构基因。用这样的结构去转化宿主生物可导致表达一种初级表达产物，该产物包含由融合到BAR1信号肽上的异种基因编码的结构蛋白，结果可使该蛋白通过宿主细胞的分泌途径加工并从宿主细胞分泌到培养基或周质空间中。

各种各样的原核和真核微生物已被用作通过DNA重组技术生产不能由宿主自然产生的异种多肽的宿主。人们对真核生物中的各种真菌具有特别的兴趣，包括啤酒酵母菌、梨酒酵母菌（Schizosaccharomyces    Pombe）、曲霉菌属（Aspergillus）和脉胞菌（Neurospora）。尤其是对属于芽生酵母的啤酒酵母菌作了许多工作。用一个合适的DNA结构如质粒转化酵母细胞，已能使其表达包含在该质粒中的异种基因。然而，这一技术的主要限制是，在许多场合下，宿主细胞不能将这种蛋白产物分泌到介质中，所以必须破碎这些细胞，并在不使其变性或失活的情况下从各种污染的细胞成分中纯化所希望的蛋白质。所以，希望能引导这些转化细胞分泌能简化产品提纯步骤的异种产物。此外，希望一些蛋白质进入到宿主细胞的分泌途径以便于进行合适的后加工，即形成二硫键。

已知啤酒酵母菌分泌一些天然产生的蛋白质，但是，有关这一过程的知识与由细菌和哺乳动物细胞分泌蛋白质所知道的相比是十分有限的。大多数分泌出来的酵母蛋白质似乎都是保持在周质空间的酶，但转化酶和酸性磷酯酶也可能与细胞壁结合。已知由啤酒酵母菌分泌到培养基中的蛋白质包括接合信息素（α-因子和α因子）、致死毒素以及引起Barrier活性（以下简称“Barrier”）的蛋白质。穿过细胞壁进入介质中的分泌也称为“输出”。啤酒酵母菌的接合型α细胞产生分泌到培养基中的α-因子，而α细胞产生两种分泌多肽，α-因子和Barrier因子。α-因子的基因已进行了克隆、序列测定和分析（见Kurjan和Herskowitz，Cell    30∶933-943，1982）。信号肽（一种被认为是引导细胞分泌一种附着蛋白质的短肽序列）、引导序列（Leader    Sequence）（包括一个从成熟的α-因子上切下的多肽前体）和来自α-因子的非转译基因序列（包括启动子和调节区）可用于引导在酵母中产生异种蛋白的分泌（Brake等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA    81∶4642-4646，1984）。α-因子的表达由MATα1基因产物调节，而且将α-因子前体加工成成熟的蛋白质似乎至少需要两步，并认为是处于STE    13和KEX2基因的控制之下。

与α-因子相对比，Barrier因子基于它与伴刀豆球蛋白A结合的能力似乎是糖基化的。Barrier因子是由α细胞产生，其表达似乎是在MATα-2基因的控制之下。除了可能的信号肽切割外，至今未表明Barrier因子前体的加工，而且认为STE13和KEX2基因与Barrier因子的表达无关。

由于在α-因子和Barrier因子的表达控制和加工之间有上述不同，人们无法事先确定这些酵母基因中的那一个更适于引导分泌一个特定的异种蛋白。由于这两种蛋白质似乎是通过不同的分泌途径而加工的，所以希望利用Barrier因子分泌系统的特征。

因此，本发明的一个目的是要提供这样的DNA结构，它含有至少编码信号肽的BAR1基因片段，还包含一个外来结构基因，它在微生物宿主里表达后可产生一种异种蛋白，该异种蛋白通过宿主细胞的分泌途径而加工。

本发明的另一个目的是提供在一种微生物宿主里表达异种基因的方法，产生一个由该基因编码并由该宿主细胞的分泌途径加工的异种蛋白或其一部分。

本发明的另一个目的是提供一个从一种微生物宿主分泌异种蛋白的生产方法。

本发明进一步的目的是提供一个通过DNA重组技术产生异种蛋白的方法。

本发明另一个目的是提供一个通过DNA重组技术生产具有人胰岛素原和胰岛素的氨基酸序列的蛋白质。

这些目的和其它一些目的由以下对具体实施方案和权利要求的描述将成为显而易见。

本发明涉及DNA结构和利用它们的方法，这些结构至少包含有啤酒酵母BAR1基因的信号肽编码序列，至少一个与宿主生物不同的结构基因，以及在含有BAR1信号肽和该异种蛋白的融合蛋白的宿主生物中控制表达的启动子。

在附图中：