[其他]直接将DNA插入质体和线粒体

说明书

本发明是一种定向的直接将基因转移到植物细胞原生质体中的质体或线粒体，特别是叶绿体中的一种方法。对本发明来说，植物是进行光合作用的单细胞或多细胞的有机体。植物细胞原生质体是用纤维素酶部分或全部处理细胞壁物质转变而成的植物细胞。

叶绿体成为某些类除草剂的目标，例如三嗪除草剂。近来发现，阿特拉津（Atrazine），一种三嗪类除草剂，作用于称为psb    A的叶绿体基因（Hirschberg等，1984）所编码的32千道尔顿（Kd）的多肽。psb    A的编码区中的一个单核苷酸的取代导致在32Kd多肽中的一个氨基酸的取代，从而赋予对阿特拉津的抗性。在杂草中发生这种突变的有，例如绿穗苋和龙葵。

能直接引进基因到植物，特别是农作物的质体和线粒体的基因组中去，是人们的宿愿。这样将能引进新的基因和所期望的特征到所希望的植物中去。例如，赋予除草剂抗性基因，为了在对除草剂敏感的叶绿体中产生除草剂抗性是必要的。

至今，为了得到对在叶绿中具活性的除草剂的抗性或耐性，人们已开始操作植物细胞核的染色体组。但是，这样一种策略，仅付与对这些除草剂以耐性而不是真正的抗性。还不能通过直接的基因转移使作物具有对叶绿体作用的真正抗性。因此，也不能认为用这种方法能够转化诸如叶绿体的质体。

引进一个具有期望特征的基因，例如除草剂抗性到植物核染色体组的另一个缺点，是由于这种抗性也通过授粉引入了某些杂草。这种杂交将提供将所期望的特征引进杂草中去的机制。

为引进基因到植物细胞核染色体组中去的最普遍的方法是，用致病菌侵染细胞，例如含有Ti质粒载体系统的土壤杆菌属（农杆菌属）（Agribacterium）（Barton等，1983，Chilton等，1985）。

这种方法由于侵染而受到损害。其缺点包括限于宿主的特异性和必须将转化的植物细胞与用于转化程序的病原分开。在环境中释放这种病源菌已引起关注（Roberts，1985）。

De    Block等（1985）报导利用土壤杆菌属Ti质粒载体系统将一个编码抗生素抗性基因引进能够再生整个细胞和完整植物的烟草原生质体的叶绿体基因组。然而这些研究者发现在无抗生素存在的情况下，基因是不稳定的，并且在很短的时期内便消失了。只有在抗生素选择的情况下，植物才能保持引进的基因，因此没有实际的应用价值。

直接地以缺口线状或环状质粒DNA转化植物细胞原生质体的方法也是众所周知的（Pasz-Kowski时，1984;Schilperoor等1983）。这种方法无需用病源菌侵染植物细胞，然而到目前为止，这种方限于对核的转化。

为了能够授与植物细胞有利的新的性质，而不用病源菌侵染防止这种性质被转移到杂草中去，需要一种允许直接转移有用基因进入质体和线粒体基因组的方法。更进一步需要一种能直接将基因稳定地转移到植物细胞的质体和线粒体以及整个植株的方法，以使在田间作物生长发育期间，基因能稳定地表达而不致丢失。

因此，本发明的主要目的，是提供一种直接将基因引进维持在质体和线粒体，特别是叶绿体中，而不用病源侵染的方法。本发明的进一步目标是产生含有遗传工程组建的质体或线粒体，能稳定地维持和表达引进性状的植株。

这个和另一个目标从下面说明中可以看到，由于提供一个将在质体或线粒体中含有一个或多个在质体或线粒体中具有功能的启动子的基因的DNA，直接引入植物细胞质体或线粒体的程序，这程序包含暴露DNA于在培养基中的原生质体，给予一个充分的时间，让DNA渗入原生质体和原生质体中的质体或线粒体，而无需将原生质体暴露于病源菌。

图1是概述构建质粒pCAT°和p32CAT的步骤程序方框图。

图2是概述构建质粒pUCHl的步骤的程序方框图。

图3是概述构建质粒pBRCAT步骤的程序方框图。

图例

X＝XhoⅠ

S＝SmaⅠ

H＝HindⅢ

B＝BamHⅠ

RⅠ＝EcokⅠ

Sl＝SalⅠ

LⅠG＝T₄DNA连接酶的连接作用

X/S1指示一个Xhol位点连接在一个SalⅠ位点的一个两种酶都不能酶切的杂交位点。

CAT表示氯霉素乙酰（基）转移酶的编码区。CAT°表明CAT基因无启动子的形式。

在图1～3中，psb    A基因用黑色线条指示，

它的启动子用黑色的框表示。

图1～3中，CAT编码区用点表示。

以下定义适用于发明申请专利的说明书和权利要求书;