[其他]编码序列的突变

说明书

本发明关于一种具有突变的α-1-抗胰旦白酶编码序列的大肠杆菌表达载体，这种突变导致了一种变异的α-1-抗胰旦白酶表达水平的增加。

α-1-抗胰旦白酶（AAT）是存在于血清和多种其他体液中的一种α-1-球旦白。在肝脏中合成时，成熟的AAT是一种分子量为50，000到55，000道尔顿的糖旦白。可以被AAT所抑制的旦白水解酶包括胰旦白酶，胰凝乳旦白酶，胰弹性旦白酶，皮肤胶原酶，血管紧张肽原酶和尿激酶以及多形核淋巴细胞的旦白水解酶。人体中AAT的遗传缺陷往往同多种病理状态联系在一起，特别是肺气肿和肝病。例见Morse，英国医学杂志（N.Eng.J.Med.）299（19）：1045-1048（1978）和299（20）：1099-1105（1978）;Tobin等，Arch.Int.Med143（7）：1342-1348（1982）;以及Carrell等，自然（Nature）298（5872）：329-334（1982）。

弹性旦白酶是一种破坏肺组织的旦白酶，它的活性如不被抑制则会导致肺气肿。例如在Gadek等美国呼吸疾病年签（Am.Rev.Respir.Dis.），127S45（1983）和Glaser等美国呼吸疾病年签，127：547-553（1983）的文章中已经阐明AAT可以用于治疗肺气肿。

由于它可以用于治疗而且对某些适应症，例如对ATT遗传缺陷病人以补偿治疗时需要的量比较大;因此科研工作者一直在寻求一种大量生产AAT的技术。这种技术习惯上包括从血浆中提纯AAT。例见Coan等，美国专利4，379，087。

Courtney等在EP-A-114，777中公开了缺失AATN-末端谷氨酸的一种AAT融合旦白在大肠杆菌中的表达。Courtney等还报告，在大肠杆菌中非融合AAT的表达十分低。

Courtney等在Nature，313：149（1985）中报告在大肠杆菌中具有活性位点突变的变异AAT的合成。

Bollen等在比利时专利895，961中报导了AAT克隆至大肠杆菌一种质粒pULB1523中，这种质粒由人肝细胞产生的多聚腺苷酸-核糖核酸（polyA-RNA）逆转录的cDNA（互补脱氧核糖核酸）1.4千碱基对片段克隆至pBR    322质粒PstI酶切位点而形成。Bollen等还阐明，cDNA片段包括整个AAT基因及其天然翻译起始密码。

Bollen等人在DNA（脱氧核糖核酸）2∶255（1983）的文章中，报导了pULB1523和pKT    287这是一种导致在大肠杆菌中表达β-内酰胺酶-AAT融合旦白质的表达载体。

Bollen等在欧洲生物化学通信（FEB    S    Letters）116（1）：67-70（1984）中报导了利用λ启动子PR在大肠杆菌中表达AAT。而试图证明大肠杆菌来源的AAT的生物活性未能成功。

Parker等在澳大利亚专利申请31801/84中，报导了AAT在大肠杆菌中的表达。

Munson等在微生物学杂志（J.Microbiol.）177：663-683（1984）的文章中报告了大肠杆菌LacZ基因的突变导致β-半乳糖苷酶表达的增加。Myers等在Scierce，229：242（1985）文章中报告了在没有表型选择的条件下，确定突变DNA分子的电泳步骤。

一方面，本发明是一种由突变的AAT编码序列组成的重组DNA分子，其中突变由AAT编码序列的1-15密码子内的一种变化组成，假定突变是除外或附加以ATG密码取代天然编码序列的第一个密码子。

另一方面，本发明是一种具有插入DNA分子的大肠杆菌表达载体和一种用本发明的表达载体转化的大肠杆菌。本发明也是一种生产具有AAT生物活性，即抗胰旦白酶和抗弹性旦白酶活性多肽的方法，其中包括在允许的条件下，培养本发明的转化大肠杆菌和分离这样产生的AAT。

再一方面，本发明是一种变异AAT旦白，它具有AAT生物活性，但在1-15位内氨基酸序列有改变，并假定这种改变是除外或附加成熟AAT第一位上的谷氨酸残基的取代;本发明是一种抑制动物包括人肺的弹性旦白酶活性的药物，它由这种变异了的AAT旦白质和药用的载体所组成;本发明也是一种抑制动物包括人肺弹性旦白酶活性的方法，这种方法包括给动物服用有效剂量的抗弹性旦白酶变异AAT旦白质。