[发明专利]新的固相生物催化剂及其制备和应用

说明书

本发明是关于含有活细胞的颗粒形式的新的水不溶性固相生物催化剂及其制备和应用。

在美国专利3，838，007号中揭示了一种制备半固体或固体颗粒形式的水不溶性酶组合物的方法，即将非蛋白水解酶悬浮在胶凝蛋白水溶液中，将得到的混合物与一种微混溶于水或不混溶于水的有机液体合并制成一种颗粒形式的悬浮液，处理该悬浮液实现胶凝蛋白的凝胶化并使生成的胶化蛋白颗粒与交联剂接触。胶凝蛋白最好是明胶，它对使酶成为具有所需大小的水不溶性的颗粒形式是必不可少的并且它也可使酶稳定。尤其揭示了产生颗粒形式的酶一胶凝蛋白是具有四个或更多的碳原子的脂族醇，例如丁醇，醇酯和低级脂肪酸酯，如乙酸乙酯，乙酸丁酯和丙酸乙酯。最后，提到几种非蛋白水解酶，它们可成为不溶性的颗粒形式。上述颗粒形式的组合物可用于酶促反应的柱和床反应器并且特别有助于那些不充许最终产物含有所用酶的反应。

本领域技术人员会意识到活细胞，例如面包酵母（酿酒酵母）的细胞可迅速地被在美国专利3，838，007号所揭示的方法中所用类型的有机溶剂杀死。据报道几种有机溶剂可引起酵母的自溶。例如，用乙酸乙酯处理面包酵母制备结晶细胞色素C（见Nature178（1956），629-630）和β-呋喃果糖苷酶（见J.Bacteriol，112（1972），1346-1352）。

Hough和Lyons在Nature235（1972）389中特别提到共价连接酶的固相法对活的有机体来说是相当猛烈的，因此他们认为如果用这些活的有机体作为载体的话是极不可能存活的。然后他们揭示了一种用钛盐和其它无机盐作为偶联剂将某些酶与活的载体，即几株酿酒酵母共价偶联起来的技术。该偶联技术是Barker等人最初在Process    Biochem.6，（1971），11中所揭示的技术的改进。

在德国公开专利2805607，第9页，第13～17行，提及了Processes    Biochem.No.7（1972），9-12，其中建议用甲苯或二氯甲烷作为溶剂使微生物附着在三乙酸纤维素丝状体上。上述德国公开专利中特别提到这些溶剂是很有毒的，因此通过在载体间质内培养而使微生物再生几乎是不可能的。

最近，Haegerdal和Mosbach在Food    Process    Eng.，Proc.Int.Congr.，2nd    1979（1980年出版）2，129-32，（参见Chemical    Abstracts    94（1981）119457K）中描述了面包酵母与β-葡萄糖苷酶的共固定化物，为了由纤维素二糖生产乙醇在一个小的反应柱中研究了这种共固定化物。将酶共价结合到藻酸盐上，然后将面包酵母与该制剂一起共附着在藻酸盐凝胶上，但有机溶剂和交联剂都不能用于这些活细胞。

藻酸钙的缺点是在磷酸盐离子或其它螯合剂存在时不稳定。在活细胞中，磷酸盐是必需营养物，因此这种藻酸盐载体不能适用于大多数含有活细胞的固相系统。

欧洲专利申请EP-A-O041610揭示了酵母与酶的共固定化物，其中将酶偶联到具有发酵能力的活酵母细胞上以便直接圈住它们。这些共固定化物的制备方法是使酵母细胞脱水，用酶的水溶液复水，加入一种不影响酵母细胞发酵的酶沉淀剂并且最好随后加入交联剂。在制备这些共固定化物时有机溶剂和分散剂都不能使用。共固定化物不适用于反应柱等，因为它们缺乏载体间质。

所有这些参考文献都谈到在制备保持其发酵和增殖能力的固相活细胞组合物的过程中不用有机溶剂，特别是甲苯、丁醇、乙酸丁酯和乙酸乙酯一类的溶剂。

本发明的一个目的是提供含有活细胞的具有所需大小的颗粒形式的水不溶性固相生物催化剂，它们可用于各种各样的目的，例如用于柱填充物，流化床反应器和搅拌釜反应器。

本发明的另一个目的是提供一种在相当温和的条件下制备上述水不溶性固相颗粒的方法，（即颗粒内部的情况与使悬浮体成型的周围有机溶液相反），以便大量活细胞在固定化期间或之后可以生存或增殖。

从下面详尽的描述中可显见本发明的这些目的和其它目的以及优点。

在广泛的研究和实验之后，出人意料地发现了活细胞并且特别是活的微生物细胞的存活力，例如当使活细胞与微混溶于水或不混溶于水的有机溶剂接触时如果将活细胞悬浮在胶凝剂水溶液中，酵母就不会受到不利的影响。

因此，本发明提供一种含有分散在交联用的胶凝剂中的活细胞的颗粒形式的水不溶性固相生物催化剂。