[发明专利]提取菠萝蛋白酶新方法

说明书

本发明涉及一种从菠萝罐头加工下脚料中提取菠萝蛋白酶。特别是采用聚丙烯酸作为酶沉降剂从果皮汁中提取菠萝果蛋白酶的新方法。

菠萝果实及茎中含有丰富的菠萝蛋白酶。它在食品、医药、纺织、皮革等工业中有着广泛的用途。特别是用于啤酒澄清，提高啤酒的非生物稳定性及冷贮稳定性。添加1ppm即可有明显效果。此外在医疗上用于治疗水肿及炎症，烧伤外科用于脱痂，效果良好。

在菠萝罐头生产中，菠萝加工下脚料很多，一般要占投料的40-50%，以往此均作为废弃物丢掉。事实上，可以利用这些下脚料提取菠萝蛋白酶，并回收利用提酶后的菠萝果汁，减少这些废弃物对环境的污染。

众所周知，酶的分离提取一直沿用离子交换吸附，冷丙酮、酒精、无机盐沉淀等方法，这在《酶学方法》19卷第273-284页（1970年）已进行了叙述。

为寻求新型吸附剂，美国专利4318990号和英国专利1，601，155号叙述了使用特制的多孔二氧化钛微球吸附剂，用于菠萝果和茎的蛋白酶的提取。该技术主要是将菠萝果汁或茎杆汁液通过多孔二氧化钛微球填充柱，酶被吸附，然后经洗脱、浓缩、并用传统方法沉淀。得到成品酶。

1982年，英国曾有人在实验室将聚丙烯酸作为沉淀剂用于菠萝蛋白酶的纯化。

目前国内采用的菠萝蛋白酶的提取方法有高岭土吸附法和单宁沉淀法。但二者均有不足之处，前者吸附剂用量较大（约5%）酶活性收率低（50%）。后者虽工艺简单，但成品酶活性低（400，000UVABS.u/g）且提酶后影响果汁的食用价值。

综上所述，现有技术中尚无应用聚丙烯酸及其一价盐（钠、钾），从菠萝果汁中提取菠萝蛋白酶，且回收率超过70%;酶活性超过800，000UVABSu/g;同时不影响果汁食用性的报导。

本发明提供的从菠萝下脚料中提取菠萝蛋白酶的工艺过程包括：采用聚丙烯酸或其一价盐（钠、钾），作为沉降剂，加到菠萝果汁中，使酶与聚丙烯酸形成复合物沉淀。分离该沉淀，并除去聚丙烯酸，可获得菠萝蛋白酶成品。

本发明工艺过程所采用的菠萝果汁系菠萝罐头厂实罐车间下脚料包括芯、皮、挑目等经破碎、压榨、筛滤、自然放置澄清之果汁。

本发明工艺过程所采用的聚丙烯酸或其一价盐（钠、钾）是由丙烯酸或丙烯酸酯单体聚合的高分子聚合物（分子量为10⁵-10⁶道尔顿）。在酸性介质中，其羧基解离，分子带大量负电荷。不同于菠萝茎蛋白酶，菠萝果蛋白酶为一种酸性蛋白，其等电点pI4.6，在果汁的酸性介质中，酶分子表面带有正电荷。当聚丙烯酸以0.01%-0.1%比率添加到果汁中时，立即与酶分子形成絮状复合物沉淀。

在PH＜6条件下，聚丙烯酸不与单糖、寡糖、多糖、氨基酸、多肽、核苷、核苷酸等物质形成沉淀物，添加量为0.04%，即可沉降果汁中95%以上的酶活性。

使用聚丙烯酸沉降菠萝蛋白酶时，果汁的酸度最好为PH3.6-4。聚合物最好采用浓度为10%的，分子量大于400，000的聚丙烯酸钠水溶液。

添加上述聚合物之果汁经自然放置2-4小时，可明显分为两层。用虹吸或其它方法移去上层澄清果汁，下层为原体积10%左右的沉淀层，留作解离步骤之用。为减少解离步骤体积，可使用连续无孔转鼓离心机进一步分离沉淀与果汁。沉淀物用少量水洗涤并加水制成悬浮液，悬浮液的体积最好在约为原果汁体积的2-5%。

如此得到的悬浮液，可用氢氧化钠或饱和碳酸钠溶液调整pH5-8，使沉淀物复溶解，最好使溶液的酸度控制在pH6.5-7.5。然后加入可溶性二价盐溶液（如CaCl₂，5%），添加量应与聚丙烯酸钠的当量数相当或过量一些，使聚丙烯酸形成不溶性盐而与酶液分离，除去聚合物的酶液由经典方法制备固体酶。

沉淀该聚合物的可溶性二价盐可以用如：CaCl₂;MgCl₂等。

在过量的Na⁺存在时，该聚合物不与酶形成复合物沉淀。利用此离子效应，可使解离与盐析合并一步完成。例如：酶与聚合物的沉淀水悬液用饱和碳酸钠调pH5-8，复合物溶解，加入按重量计（每100升加入5公斤）固体氯化钠搅拌15分钟，同时保持以上pH，待酶与聚合物解离完全后加入15-25%（W/V）固体硫酸铵进行盐析。菠萝蛋白酶沉淀析出，聚丙烯酸则留在溶液中。通过离心或压榨分离。