[其他]在酵母中生产乙型肝炎病毒蛋白质的方法

说明书

乙型肝炎病毒（HBV）是与若干种人类肝脏疾病有关的传染因子。许多被HBV感染的人都经历一个急性的阶段，然后恢复。然而，有许多人不能根绝感染，从此成为慢性乙型肝炎病毒的携带者。HBV感染在世界的许多地方流行，有很高的感染发生率是在围产期由患慢性感染的母亲传染给她们的新生儿。全世界的慢性感染（肝炎病毒）携带者据估计超过三亿人。在这些携带者中，每年有成千上万的人死于慢性乙型肝炎引起的病变（肝硬化或肝细胞肿瘤）。

HB病毒粒子是由两组结构蛋白质组成的，即核蛋白与外壳或外表（“S”）蛋白。S蛋白除了作为病毒颗粒即Dane颗粒的主要外表蛋白外，它是澳大利亚抗原即22nm颗粒的唯一的组成要素。“S”蛋白质为一个编码389-400个氨基酸（具体数字视血法型而定）的大的开放阅读框架（ORF）的转译产物。ORF被分成三个区域其中每个区域以ATG密码子开头，具有在体外作为转译起始位点的作用。这些区域在基因上相应的从5′至3′的顺序上分别被称为pre    S-1（108-119氨基酸）、pre    S-2（55氨基酸）及S（226氨基酸）。从ORF中得出的六种蛋白质产物有以下的成份：

1）gp42（42，000道尔顿糖蛋白）＝

pre    S-1/pre    S-2/S（表示pre    S-1与pre    S-2相邻，再与S相邻）

2）p39（p＝蛋白质）＝pre    S-1/pre    S-2/S

3）gp36＝pre    S-2/S（两个糖基化位点）

4）gp33＝pre    S-2/S（一个糖基化位点）

5）gp27＝S（一个糖基化位点）

6）p24＝S

在HBVDane颗粒中所有六种蛋白质大约都是等克分子的范围。在22nm颗粒中，4个较少的蛋白大约是等克分子的范围，而gp42及p39在每个颗粒中最多只出现一个或几种分子。

22nm颗粒或HB表面抗原（HBs Ag）颗粒已从慢性感染（病毒）携带者的胞浆中提纯。由于它们的胞浆（血浆）为阳性颗粒的，这些慢性感染的携带者被称为HBs⁺。当这些携带者发动一次足够的免疫反应时能够清除感染而成为HBs^-。由于他们体内形成了抗HBs的抗体，这些人是抗HBs⁺的。因此，抗HBs⁺与疾病的痊愈是相互关联的。因而，希望能够通过HB疫苗来刺激或形成抗体-HBs⁺以提供抵抗HBV感染的保护作用。

通过实验来对这种假设进行验证。除人之外，黑猩猩是唯一的对HBV感染完全敏感的种，这可以通过黑猩猩的诸如HBs⁺、肝酶的血清水平的提高等可以数量衡量的标志反映出来。黑猩猩被用三种剂量的提纯的HBs Ag颗粒接种之后，用大剂量的传染性HBV对其进行袭击。当模拟接种的黑猩猩出现患有急性HBV感染的征兆时，用HBs Ag接种的黑猩猩得到了完全的保护而不出现任何感染的征兆。因此，在该实验系统中，由gp27及p24（仅为S区域）组成的HBs Ag颗粒已足以引起保护性的免疫。在这些现察结果的激励下，有人生产出了由HBs Ag颗粒组成的HB疫苗。

最近的实验结果表明pre    S-1及pre    S-2区域能在抵抗HBV感染的免疫中担当重要的角色。针对pre    S-1的抗体（用一个由pre    S-1的10至32个氨基酸残基组成的肽通过免疫作用诱导而得）及针对pre    S-2的抗体（用一个pre    S-2的1至26个氨基酸残基组成的肽通过免疫作用的诱导而得）在体外实验中都同样具有阻断HBV与人类肝癌细胞之间的连接的功能。抗HBs（从用缺少pre    S-1或pre    S-2的HBs    Ag接种的病人身上的血清中获得）不能产生阻断连接的作用。如果在体外模仿体内感染pre-S（即pre    S1及pre    S2全都连接起来）区域可以代表HBV与其肝细胞受体之间的连接位点，抗pre    S可以阻断HBV的连接从而阻断感染的发生。此外，还发现在从急性的HBV感染痊愈的阶段中抗pre    S的滴定度增加，表明这些抗体对痊愈所起的作用。最终，还证明用108氨基酸的pre    S多肽（27-119个pre    S-1残基与1-16个pre    S-2残基邻接）对黑猩猩进行接种在某种程度具有抵抗HBV挑战的保护作用。总之，这些实验现象表明pre-S区域是目前的HB疫苗的有用的成分。