[其他]肽定序的方法

说明书

本发明涉及到一种对肽及蛋白质进行化学定序的方法，其目的是确定组成肽及蛋白质的各个氨基酸的种类及位置。更具体地说，本发明涉及到超过经典的Edman降解系统的一种改进的方法。

天然存在的及近代由合成产生的蛋白质和多肽都是由氨基酸长链组成的化合物。在所有的生命体中都发现有蛋白质并在生命体中具有激素、结构基本成份、酶、免疫球蛋白及生命物质的其他组份的功能。关于蛋白质的功能及结构的研究，经常需要确定蛋白质的氨基酸排列顺序（一级结构）。为了用化学方法或应用重组体DNA技术来合成蛋白质或部份蛋白质（如生长激素抑制素、胰鸟素、内啡肽等），在尝试进行合成之前通常必须确定该种蛋白质所含的氨基酸顺序。在包括蛋白质（如免疫球蛋白、酶、病毒外壳蛋白及细胞表面蛋白）功能的探索中，在试图阐明蛋白质作用的机理时，必须确定蛋白质或多肽的一级结构。在重组体DNA方法研究中，必须确定一级结构以阐明为该一级结构编码的相应的DNA或RNA结构。

在测定蛋白质或多肽中氨基酸的基本顺序时，通常是用一种逐步降解法，在该方法中，将单个的氨基酸逐个地从多肽末端除下以便进行鉴定。Edman降解作用是较好的方法，但是也发展了一些其他的方法并可在某些情况下应用。在Edman降解作用中，是使N-末端氨基酸残基与一种能有选择性地从蛋白质上除下该氨基酸残基的试剂来进行反应以从蛋白质的末端除下氨基酸。所除下的氨基酸衍生物可转变成一种稳定的化合物，用化学方法可将该化合物从反应混合物中分离出来并进行鉴定。

在五十年代由Edman提出的逐步降解蛋白质及肽的方法〔Edman，P.，斯堪的纳维亚化学学报，4，283（1950）〕在过去35年中几乎没有什么改变，如图1所示，该三步的反应过程包括在碱性或无水条件下，在一种溶剂中，使含有N氨基酸的一种肽的N-末端氨基酸偶合到异硫氰酸苯酯（PITC）上（图1A）。用液-液萃取法（通常用重复的步骤）除去过量的试剂（过量500至10，000倍克分子）并在真空中除去溶剂。然后用无水酸使N-末端氨基酸裂解以形成氨基-末端氨基酸的一种苯胺基噻唑啉酮（ATZ）衍生物以及N-1长度的氨基酸的一种游离肽的盐，此种肽是除去了末端氨基酸的原本的肽。图1B。在真空中除去裂解的酸并从留在液相中的残余肽中萃取氨基酸的ATZ衍生物。然后，接着就使这种及不稳定的ATZ氨基酸与酸的水溶液反应而转变成一种较稳定苯乙内酰硫脲（PTH）氨基酸。图1C。然后将此缩短了的残余肽（N-1氨基酸）用PITC处理以引发另一次降解循环。然后用色谱法鉴定所得到的PTH氨基酸。对于肽中的每个末端氨基酸，用重覆上述的步骤处理。

液相手动的EDMAN技术

在发展的早期，Edman降解技术是用手动来进行的。反应室是一支试管或相似的容器，有时使用一种特殊的罩子，使试剂的添加及除去可在一种惰性气氛中进行。用注射器或移液管来加入试剂而试剂的清除则用真空操作或将其溶解或萃取入一种溶剂中。在偶合的过程中，将蛋白质或肽溶解于一种碱性偶合缓冲液中。这种方法对于大的蛋白质分子是无效的，因为它们相对地不溶于这种碱性介质中。

在偶合之后，在除去偶合缓冲液及不需要的付产物时出现了许多问题。在这种技术中的一个难题是所留下的肽衍生物可能干燥成为一种胶质薄膜，而难以从其中除去反应的付产物。应用冷冻-干燥的一些方法试图减轻这一难题。另一个非常大的难题是除去非挥发性物质，因为在将这类物质除去时，肽的PITC衍生物也易溶于同一溶剂中，因而要未留下过量的PITC要未就是使样品损失。有一种方法是将挥发的试剂除去而留下干的PITC-衍生物及不挥发的付产物。然后选择一种或几种易于溶解不需要的物质而较难溶解PITC-肽的溶剂来洗涤该剩余物。然而那些需要除去的物质易于被截留在不溶的PITC-肽的基体中。另一方法是将PITC-肽及其他物质溶于一种含有非极性溶剂的偶合缓冲液中并搅拌之，而非极性溶剂与偶合缓冲液是不相混的。这些其他物质在非极性溶剂中的溶解度很大故可用此种溶剂萃取，而留下极性较强的PITC-肽则溶于极性的缓冲液中。溶有可溶解物质的非极性溶剂可形成一个分离层，而此分离层可用移液管将之除去。但是此步骤似乎将某些PITC-肽萃取到非极性溶剂中。要除去萃取溶剂而不同时除去一定数量的PITC-肽和极性溶剂而且也不让氧气进到容器中是极难办到的。