[其他]赤豆叶肉原生质体分离培养与绿苗分化技术

说明书

本发明是赤豆（Phaseolus    angularis）叶肉原生质体的分离制备、培养、愈伤组织诱导、扩增及绿苗分化的整套方法。本发明适用于豆科植物菜豆属赤豆（Phaseolus    angularis    Wight）叶肉原生质体分离，培养与绿苗分化。

豆科植物的原生质体培养是具重要经济价值的豆类作物遗传操作的重要手段，它在植物基因工程遗传转化受体系统方面的应用，以及在细胞融合，体细胞变异的选择利用等研究方面已显示出巨大潜力。但据1986年报导，豆科植物从原生质体再生植株仅限于苜蓿、车轴草、胡芦巴等少数种类。至于籽粒用豆科植物原生质体培养成苗的研究工作至今未见报道。本发明在赤豆原生质体分离、培养、愈伤组织形成及绿苗分化上的成功，是籽粒用豆科植物原生质体培养的一个突破。

从赤豆叶肉原生质体培养至绿苗分化的过程中，对于被酶解后分离出来的原生质体进行培养是关键的一环。本发明在原生质体培养基中采用0.5-0.65M浓度的葡萄糖作为碳源和渗透压稳定剂。

众所周知，试验材料的生理状况是影响豆科植物原生质体培养能否取得成功的重要因素。本发明采用接种11-16天的赤豆无菌苗真叶为游离原生质体材料，具有取材方便，材料生长旺盛等特点。本发明采用的酶解液成份是与含量是：CaCl₂·2H₂O，1480.0mg/L;KH₂PO₄，27.2mg/L;KNO₃，101.0mg/L;MgSO₄·7H₂O，246mg/L;CuSO₄·5H₂O，0.025mg/L;KI，0.16mg/L;Mannitol，130g/L，并在其中加入0.5%-1%（W/V）的纤维素酶和0.5%-1%（W/V）的半纤维素酶，该混合酶液经12-16小时，在25℃-27℃的温度条件下振荡酶解。酶解完成后用400目镍丝网过滤酶解液，可得产率高，活力强的原生质体。

本发明提出一种适合于赤豆叶肉原生质体培养的基本培养基成份。其中无机盐成份中含有600-1000mg/L的CaCl₂·2H₂O，1200-1500mg/L的KNO₃，200-300mg/L的NH₄NO₃，60-90mg/L的KH₂PO₄，600-900mg/L的MgSO₄。与常用的MS培养基（见Murashige，T.and Skoog，F.，1962，Physiol.Plant，15：473-497.）相应的成份与用量相比，本发明的培养基的无机氮源含量低，KH₂PO₄含量亦较低，但MgSO₄·7H₂O含量明显增加。基本培养基的维生素成份中含有0.02-0.08mg/L生物素，0.1-0.8mg/L叶酸，100-200mg/L的肌醇，3.0-3.5mg/L的盐酸硫胺素，0.5-0.8mg/L的盐酸吡哆素，1.0-2.0mg/L的甘氨酸，3.0-4.0mg/L的烟酸。与上述MS培养基相比，除甘氨酸以外，各种维生素含量都有了提高，而且增加了生物素与叶酸二类物质。试验结果表明，使用增加维生素，增加镁离子含量，降低无机氮源浓度的培养基成份，原生质体植板率可以达到5.5%。

本发明以0.5-0.65M葡萄糖作为唯一碳源和渗透压稳定剂。这一条件最适合赤豆原生质体的生长，分裂和愈伤组织形成。采用不同糖的种类，并改变各种糖的使用浓度，试验结果差别很大，其中以葡萄糖作为唯一的碳源和渗透压稳定剂最适合赤豆原生质体的生长和分裂。不同浓度的葡萄糖也影响到试验结果，采用0.5-0.65M浓度的葡萄糖时，原生质体再生细胞的生长状态正常、分裂也旺盛。低于0.5M时，生长状态明显下降，植板率为0;而高于0.65M浓度时，再生细胞就极少分裂或不分裂。若以蔗糖作碳源，甘露醇作渗透压稳定剂，同样是0.5-0.6M浓度的糖，再生细胞的生长状态均见下降，前者未见分裂，后者极少分裂。因此从试验结果可以看出，蔗糖或是甘露醇对于赤豆叶肉原生质体的生长和分裂似有某种程度的抑制作用。