[其他]改良产抗菌素微生物的新方法

说明书

本发明提供了一种提高产抗菌素微生物之产生抗菌素能力的新方法。该方法包括用于表达基因产物的DNA编码序列转化微生物宿主细胞-其中基因产物在所需的抗菌素生物合成途径中起限速作用。本发明还提供了编码抗菌素生物合成基因产物的相关DNA序列、重组DNA表达载体以及转化的微生物宿主细胞。

本发明代表了重组DNA技术在产抗菌素微生物如链霉属微生物中的早期的并且是很重要的商业化利用。在本发明之前，对重组DNA技术的开发和利用大部分是局限在大肠杆菌及哺乳动物细胞内表达特定的多肽。这些进展使我们可以比较简单地表达异源基因产物，如人胰岛素A和B链、人胰岛素原、人生长激素、人反应蛋白C、人组织血纤维蛋白溶酶原激活因子、牛生长激素及其它几种有潜在应用价值之化合物。在上述各情况中，异源基因的表达或多或少都是独立的，并且没有作用于或参与或调节每个起作用的生物合成途径。现在，重组DNA技术已能够用于改善选择的生物合成途径，以提高抗生素或抗微生物前体的表达产率。

应用于链霉菌属及其它产抗菌素微生物的大多数重组DNA技术仅是限于对克隆载体的研究开发。早期的尝试包括有Reusser在美国专利4332898号中以及Manis等人在美国专利4273875号4332900号、4338400号和4340674号所公开的方法。在这些较早的文献中并没有公开过有关对链霉属的转化技术。但曾公开了产抗生素微生物中有较大应用潜力的改良载体，如Fayerman等人在美国专利4513086号中、Nakatsukasa等人在美国专利4513085号和4416994号中公开的载体。这些改良的载体包含有在链霉菌中可选择的标志、能够用于转化许多重要的链霉属菌株，并可构建进行更为复杂的基因克隆实验所需要的工具。

最近由Hopwood等人（Nature，314∶642，1985）报导了一项这样的实验。虽然Hopwood等人报导了有关新的杂合抗菌素色素的生产，但除了描述自链霉属菌株向其它菌株转移放线菌紫素色素生物合成基因外，并没有涉及增加一定的宿主细胞产抗菌素能力或生物合成效率的内容。

本发明之所以特别有用，是因为它可将重组DNA技术在商业上应用于链霉菌及其它产抗菌素的微生物。又因为临床上重要的抗菌素有一半以上是由链霉菌产生的，故特别期望开发可应用于这些微生物的方法。本发明提供了这类方法，使之可以克隆增加抗生素生产能力的基因以及能在产抗菌素微生物中生产新抗菌素及抗菌素前体的基因。

为使本发明公开清楚起见，兹对有关术语定义如下：

抗菌素-由某种微生物产生的物质（可以是天然的产物或经过有限化学修饰的），可抑制或阻止其它微生物或真核细胞生长，或杀死其它微生物或真核细胞。

抗菌素生物合成基因-编码某种酶活性的基因或编码某种可调节酶活性之表达产物的DNA片段。这种酶活性对于将初级代谢物转化为抗菌素中间体的酶促反应是必需的。这些抗菌素中间体亦可能具有抗菌素活性，且也许继后转变成抗菌素。

抗菌素生物合成途径-为初级代谢物转变为抗菌素中间体，并于其后再转变为抗菌素所必需的一套完整的抗菌素生物合成基因及生物化学反应。

产抗菌素微生物-可以是任何微生物，但其中不只限于游运放线菌属Actinoplanes、双岐放线菌属Actinomadura、芽孢杆菌属Bacillus、头孢菌属Cephalosporium、小单孢菌属Micromonospora、青霉属Penicillium、诺卡氏菌属No-cardia和链霉菌属Streptomyces，其可产生某种抗菌素或含有编码某种抗菌素产物的基因，如经表达，即可产生某种抗菌素。

抗菌素抗性基因-一个DNA片段，能编码使微生物对某种抗菌素能有抗性的活性。

ApR-氨苄青霉素抗性表型或使微生物产生这种抗性的基因。

宿主细胞-包含有能用某种重组DNA克隆载体转化的活原生质体的微生物。

NmR-新霉素抗性表型或使微生物产生这种抗性的基因。

抗菌素生物合成途径的运转-抗菌素生物合成基因的表达及能使初级代谢物转变为抗菌素所需要的有关生物化学反应。

重组DNA克隆载体-任何可选择的并独立复制的因素或在染色体上整合的因素，包括质粒和噬菌体，但不限于它们。这种DNA载体分子可加入或已加入了附加的DNA。

rep-附图中所用的符号，为链霉属质粒的复制起点。

限制性酶切片段-任何经一种或多种限制性内切酶的作用所产生的线性DNA。