[其他]从重组体宿主产生抑肽酶同系物及其制造方法，表达载体、重组体宿主和药物应用

说明书

本发明涉及抑肽酶同系物及其用重组体DNA技术的制造方法。

本文所述化学合成的DNA分子，其特征为新的多肽或多肽的DNA顺序编码，实质上与抑肽酶或抑肽酶同系物的氨基酸顺序及组合物一致，且具有抑肽酶或抑肽酶同系物的生物活性。

众所周知，抑肽酶是由58种氨基酸组成的肽，具有抑制胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、血浆酶和激肽释放酶的作用。这是一种基本的蛋白酶抑制因子，取自牛的脏器，是一种有价值的药物，又名Trasylol（抑肽酶），用来治疗各种疾病，如高溶解纤维蛋白原的出血和外伤出血的休克（参阅H.Fritz和G.Wunderer，1983年，《药物研究》33期，479～494页）。

业已证明，抑肽酶的同系物与抑肽酶相比在15位上是其它氨基酸，而不是赖氨酸，它是有饰变作用和疗效作用的有效蛋白酶抑制剂（德国专利DE-OS    3339693号;H.R.温泽尔等1985年在《肽和蛋白质化学》3卷）。这些抑肽酶同系物对胰和白细胞中弹性蛋白酶，以及组织蛋白酶G有强烈的抑制作用。

在急性的、慢性的破坏结缔组织，损害器壁，坏死病变和肺部组织变质的炎症中，胰腺弹性蛋白酶（胰腺炎）、血浆弹性蛋白酶（关节硬化）、白细胞弹性蛋白酶的过度释放引起的疾病，可用这种抑肽酶同系物治疗由溶酶体酶特别是白细胞弹性蛋白酶在由免疫处理引起的炎性反应中，例如风湿性关节炎中起着同样重要的作用。

虽然可从牛的脏器以及通过牛胰蛋白酶抑制因子（Tschesche，M.，Wenzel，M.，Schmuck，R.，Schnab，E.德国专利说明书DE    3339693Al从15.05.58起）的半合成转化得到抑肽酶和抑肽酶同系物，但产量较少。

可见，重组体DNA及有关技术的应用是提供必要的大量高质量抑肽酶同系物的有效方法。目的是生产抑肽酶同系物，及生物活性，宿主生物体是用重组体DNA技术的产品。

在微生物中，异种DNA的表达方法是熟知的。

已知氨基酸顺序的多肽DNA编码的制备，可用基因组DNA顺序、与mRNA互补的cDNA顺序或根据遗传密码及制备合成基因的选择密码子。

从牛胰腺的胰蛋白酶抑制因子基因中牛基因组克隆的部分DNA顺序的克隆已由S.Anderson和I.B.Kingston（1983年，Proc.Natl.Aead.Sci.USA.80卷，6838～6842页）说明了牛胰腺胰蛋白酶抑制因子（BPT1）基因组克隆的特征。

近来已把BPT1和牛脾抑制因子Ⅱ的大片段牛基因组编码编成顺序，已由Kingston，I.B.和Anderson，S.发表（1986年，《Biochem.J.》233期，443～450页）。

本发明的目的是提供抑肽酶同系物、及其核酸编码、结合核酸和其它转化细胞的载体，以及获得抑肽酶同系物的方法。

对于本发明的目的，最有利条件是以恰当设计制备合成基因以及可以广泛应用的选择密码子。

特别是这种情况，构建包括DNA编码组或由限制酶的独特识别部位限定的DNA组的合成主导基因。这种基因设计在DNA编码组内，可使全部DNA顺序容易饰变或突变。

由重组体DNA技术制备抑肽酶同系物，如Val-15-、Ile-15-、Leu-15-、Phe-15-和Ala-15-、Arg-15、Gly-15、Ser-15、Trp-15、Tyr-15、单独抑肽酶，或与在52位上由Glu、Leu、Val、Arg或Thr取代的相结合，业已发现与已知的抑肽酶及其同系物是等同的，在52位上有Met，它们的生产方法将一起介绍。取代Met-52，可生产抑肽酶和抑肽酶同系物，其中在融合多肽的Met位上，用溴化氰把遗传工程的融合多肽切断。

还介绍了这种同系物的合成DNA编码，包括表达该同系物结构基因的重组体质粒，以及由重组体质粒转化的大肠杆菌（E.coli）。

下文说明编码抑肽酶和抑肽酶同系物的DNA片段的构建和选择方案。

已知蛋白质顺序及抑肽酶和抑肽酶同系物的遗传密码用来确定这种多肽的DNA顺序的编码。

遗传密码的简并性允许在任何给定的氨基酸顺序的密码子选择中有很大的灵活性。

测定标示这种蛋白质的氨基酸顺序的密码子中所有可能的碱基取代。与此相应可测定定位在合理的DNA顺序内全部潜在限制性部位。

通过下述依据指导主导基因的密码子选择：首先，选择密码子和片段，设计片段组合，以避免不合适的片段互补性。

其次，富集A-T碱基对的范围，避免用早期转录的末端解决问题。