[其他]同位素标记蛋白质抗原纯化新工艺

说明书

本发明属生物化学领域，是放射免疫测定药盒制备中，同位素标记的蛋白质抗原纯化的新工艺。

在制备放射免疫测定（RIA）药盒时，使用¹²⁵I等同位素标记蛋白质抗原常会使蛋白质发生降解，使标记后的蛋白质抗原纯度下降，达不到较高的纯度，直接影响RIA的质量和测定的准确性。如果标记抗原与过量抗体的结合率低于80%，RIA则不能建立。

本发明的目的是建立一种使标记后的蛋白质抗原纯度增高，而且简便，快速纯化蛋白质抗原的新工艺方法。

本发明的技术构思特点是：首先采用常规的聚丙烯酰胺凝胶平板电泳技术，使标记蛋白质抗原纯化到电泳纯水平。然后用放射自显影技术在平板凝胶上准确地显示标记蛋白质的位置。並把相当位置的凝胶裁割下来备用。最后用电泳法将凝胶上标记的蛋白质洗脱下来，收集、分装。

本发明的工艺分三步：

一、同位素标记蛋白质抗原的平板电泳：

使用常规的垂直或水平聚丙烯酰胺凝胶平板电泳，也可以使用十二烷基磺酸钠（SDS）-聚丙烯酰胺凝胶平板电泳和等电聚焦平板电泳。样品（如白细胞三烯A₄水解酶）与2-3倍体积的样品缓冲液混合，然后将样品分为3-10份，每份量在50微升以下，把每份样品分别加入凝胶的加样井中。使用SDS-聚丙烯酰胺凝胶垂直平板电泳时，应使用双层胶技术，即在7-15%凝胶（分离胶）的上面加一层1-2cm高的2.0-4.0%凝胶（样品胶），以使样品浓缩后进入分离胶，可提高分辩率，提高蛋白质抗原纯化程度。加入样品后，通直流电2毫安;当指示色带进入分离胶后，电流提高至4毫安;当指示色带到达凝胶底端时，停止电泳。电泳时间约4小时。

二、标记抗原的放射自显影定位：

将电泳后的平板凝胶取下，包一层保护膜，在暗室内取相应尺寸的χ光底片一块，放在凝胶下面，固定在暗盒中曝光（曝光时间随同位素种类和使用剂量而异）。底片经显影、定影、清晰地显示标记蛋白质的位置。图1是放射自显影的定位凝胶图。〔1〕为所需要的蛋白质在凝胶上显示的条带。〔2〕为降解蛋白质和杂质的条带。将所需要的蛋白质条带〔1〕裁割下来，置于冰箱中备用。

三、标记蛋白质抗原的电泳洗脱：

图2是同位素标记蛋白质抗原的电泳洗脱图。〔1〕为电泳槽，（20×10×5cm），〔2〕电极，〔3〕缓冲液Ⅰ〔5毫克分子，三羟甲氨基甲烷（triS）〕，（2.5毫克分子醋酸，PH8.6），〔4〕为透析袋，〔5〕缓冲液Ⅱ（缓冲剂Ⅰ+0.05%牛血清白蛋白），〔6〕为凝胶块。

电泳槽内盛满缓冲液Ⅰ，取直径为1-2cm的透析袋一段，于缓冲液Ⅰ中浸泡3-10分钟，将透析袋内装满缓冲液Ⅱ，同时装入含有同位素标记蛋白质抗原的凝胶块，扎紧透析袋，以系带固定于电泳槽上，使透析袋与电极平行。通过稳压直流电200伏，电泳1小时左右，电泳后将透析袋中含有同位素标记抗原的缓冲液Ⅱ，吸出、分装，纯化过程即完成。

以白细胞三烯A₄水解酶（LTA₄H）放射免疫测定药盒制备中用1¹²⁵Ⅰ标记LTA₄H的纯化为例：

取¹²⁵I-LTA₄H5微克，100微升，比放射强度120微居里/微克。样品分子量70，000道尔顿，¹²⁵I标记前，样品纯度为90%以上，标记后与过量抗体的结合率为68%，（使用抗LTA₄H兔抗血清，1∶10稀释，培育48小时，4℃，加入1∶5羊抗兔免疫球蛋白抗血清，培育24小时，4℃，离心后分别测上清液与沉渣的放射活性，计算出结合率）。

1、采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶垂直平板电泳：

¹²⁵I-LTA₄H100微升，混入300微升样品缓冲液，将样品分为10份，加入凝胶的样品井中。样品胶为3.0%聚丙烯酰胺，分离胶为10%，采用阴离子电泳系统，电极缓冲液为三羟甲氨基甲烷（triS）3.0克，甘氨酸14.4克，SDS1.0克，加水至1升，pH8.8，加入样品后，电泳槽的上槽接负极，下槽接正极，通直流电2毫安1小时，样品色带进入分离胶后，电流加至4毫安，2-3小时，色带到达凝胶底端，停止电泳。