[其他]克隆限制修饰系统的方法

说明书

本发明是有关克隆限制修饰系统的方法，由此产生的克隆，和用克隆生产限制酶和（或）修饰酶的方法。具体讲是有关DdeⅠ和BamHⅠ限制性核酸内切酶和修饰性甲基化酶的克隆以及这些克隆和酶的生产方法。

限制性核酸内切酶是天然存在于细菌中的一类酶，细菌中含有此酶的成分经分离提纯可在实验室中用于裂解DNA分子成为DNA片断。此类酶的这种性质便于DNA分子的鉴定和基因成分的分部分离。已经证明限制性内切酶是现代遗传学研究所不可缺少的工具，在遗传工程和遗传分析中被誉为生物化学的“剪刀”。

限制性核酸内切酶能够识别DNA分子并结合在专一的核苷酸序列（“识别序列”）上。限制性核酸内切酶一旦与DNA结合上，就能在专一序列的内部或端部进行切割。不同的限制性核酸内切酶对不同的识别序列亲和性也不同。目前从数百种细菌中已鉴定出有将近一百种不同的限制性核酸内切酶。

在每一种细菌中往往只含有极少量的限制性核酸内切酶。这类酶多根据来源菌的名称命名。比如埃及噬血菌（Haemophilus aeqyptius）所合成的三种不同的限制性核酸内切酶分别命名为HaeⅠ，HaeⅡ和HaeⅢ。这三种酶的识别序列及切点分别为（AT）GGCC（AT），Pu GCGCPy和GGCC。再例如大肠杆菌RY（Escherichia coli RY₁₃）只合成一种限制性核酸内切酶，定名为EcoRⅠ，其识别序列为GAATTC。

事实上，限制性核酸内切酶对细菌细胞的生长具有保护作用，它可使细菌抵御外源DNA分子的入侵，如病毒和质粒DNA，这种外源DNA可破坏或寄生于细菌细胞。限制性核酸内切酶可沿外源DNA分子扫描，每发现一个识别序列就进行切割，从而使细菌对外源DNA具有抗性。切断了的外源DNA不能成为入侵基团并且对非专一性核酸内切酶的进一步降解作用更加敏感。

细菌保护系统的另一成分是修饰性甲基化酶。这类酶与限制性核酸内切酶在功能上互补能够识别和区分内外源DNA。修饰性甲基化酶在DNA上的识别及结合序列与相应的限制性核酸内切酶相同，但不打断DNA。此酶只在识别序列内某一个或另一个核苷酸残基上进行化学修饰即加上一个甲基基团。甲基化后的识别序列不再被限制性核酸内切酶结合或切断。细菌细胞的DNA在甲基化酶的作用下充分甲基化，因而细菌DNA对内源性限制性核酸内切酶的存在丝毫不敏感，只有未被甲基化的，外源性的DNA才易被限制性核酸内切酶所识别和攻击。

随着遗传工程技术的发展，目前有可能用克隆基因的方法来生产蛋白质和酶，比起常规提纯的方法其基因的编码量要大得多。分离限制性核酸内切酶克隆的关键是找到一种简单可靠的方法在复杂的“库”中鉴别出这种克隆。即在克隆频率为10^-4到10^-3用“鸟枪法”诱导克隆的程序。较优选的方法是能使大量不需要的克隆被破坏掉，而少量理想中的克隆被保留下来。