[发明专利]合成和分离肽的酶膜方法

说明书

本发明一般是关于使用一种对不带电的肽可渗透而对带电的肽不渗透的膜合成和分离肽的酶促方法，尤其是关于同时合成和纯化L，L-二肽，以及将其应用于制备L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯（天冬甜母）。

众所周知，从早期蛋白质化学以来，使用蛋白酶作缩合催化剂立体定向偶联两个氨基酸生成L，L-肽。早在1909年，Mohr和Strohs    chein描述了在降解酶蛋白质的木爪蛋白酶存在下，B2-Leu-OH和H-Leu-NH，反应生成不溶于水的二肽Bz-Leu-Leu-NH。E.Mohr和F·Strohschein    Ber42，2521（1909）。Mohr和Strohschein的类型反应仅在那些形成肽键的氨基酸之间进行是可能的。这些形成的肽键对使用木瓜蛋白酶或其它酶解离敏感。的确，在氨基酸反应物和肽产物之间的缩合反应平衡很大程度上向反应的氨基酸的反应物方向移动。然而，假使二肽产物是不易溶解的，且从反应相中沉淀出来，由于质量作用能驱使缩合反应的完成。

由于某些肽商业使用的重要性以及公知的在温和条件下酶催化形成肽的事实，关于肽的酶合成，特别是简单的二肽合成进行了大量的研究。K·Oyama和K·Kihara，KagakuSosetsu35·195（1982）;K·Oyama和K·KiharaChem    Tech·14，100（1984）。

肽的衍生物天冬甜母（aspartame）的合成方法在US-A-4165311中已做过介绍，此后称为“311”方法。它包括N-苄氧羰基-L-天冬氨酸与D，L-苯基丙氨酸甲酯嗜热菌蛋白酶催化缩合作用和一种中间复合物N-苄氧羰基-天冬甜母的D-苯基丙氨酸甲酯盐沉淀作用，以驱动反应到肽产物一侧。这种中间复合物进一步处理容许回收D-苯基丙氨酸甲酯，消旋后这些甲酯可重新循环使用。处理N-苄氧羰基-天冬甜母衍生物，退减N-苄氧羰基保护基团这些衍生物能转变成天冬甜母。“311”方法必须在分批基础上进行，这比较麻烦，而且使酶回收复杂化。也可参看K·Oyama，S·Irino，T·Harada和N·Hagi.Ann·N·Y·Acad·Sci434，95（1985）。Willi    Kullmann，Enzymatic    Peptide    Synthesis（1987）。

通过满足嗜热菌蛋白酶的活性部位施加于结构的需求并且通过促使中间复合物的不溶性而增加反应收率，在“311”方法中，N-苄氧羰基保护基团起主要的作用。在温和的条件下，可以进行从天冬甜母衍生物中消去N-苄氧羰基保护基团，即催化氢化作用防止甲基酯功能团解离。催化氢化涉及到大规模处理氢气的不便。

在化学文献中也已经描述过驱动酶缩合反应完成的其它方法。例如，已经发现有机溶剂作反应介质对增加肽产量收率有效，尽管它随酶稳定性下降已经使其不能大规模地实际运用。K·Oyama，S·Nishimura，Y·Nonaka，K·Kihara和T·Hashimoto，J·Org·Chem46，5241（1981）;H·Ooshima，H·Mori和Y·Harano，Biotechnology    Ietters7，789（1985），K·Nakanishi，T·Kamikubo和R·Matsuno，Biotechnology3，459（1985）。

考虑到现有技术的工艺方法中用于肽的酶合成存在上述难解决的问题，特别是沉淀一种中间复合物和处理危险试剂的需要，将提供一种改进的方法避免这些困难的问题，同时安全地提供有效收率而不快速失去酶催化剂的活性。

本发明提供了一种合成和纯化一种化合物的方法，步骤包括偶联第一种反应物和第二种反应物以生成一种膜可运载的化合物;通过膜输送可运载的化合物而该膜不输送反应物，不可逆地把输送过去的化合物转变成一种通过膜无法逆向运载的形式。

本发明也提供一种酶促合成和肽的纯化方法，步骤包括使用一种在含水混合物中用缩合酶偶联第一种氨基酸化合物和第二种氨基酸化合物，第一种氨基酸化合物含有一种质子化了的氨基团（铵），第二种氨基酸化合物含有一种游离的羰酸酯基团，产生一种不带电（或非电离）被偶联的化合物;通过一种膜渗透从含水的混合物中持续移去不带电的被偶联的化合物，这种膜选择性地运载不带电被偶联化合物到膜的产物一侧。该运载的偶联化合物是一种肽或其衍生物，它们转变成一种带电（或电离）的分子以致通过膜不发生逆向扩散。因而由于它不断地从中被去除，在反应混合物中有利于形成偶联的化合物产物。