[其他]人体胰岛素前体转化为人体胰岛素的方法

说明书

几年来人们已经认识到用胰蛋白酶和羧肽酶B使胰岛素原转化为胰岛素的能力〔参阅Kemmler，W.，Clark    J.L.，Borg.J.and    Steiner，D.F.，Fed.Proc.30    1210页（1971）;Kemmler，w.，Peterson，J.D.，and    Steiner，D.F.，J.Biol.Chem.，246    6786-6791页（1971）〕。应用这种转化的方法，在进行中迂到的困难是，并且继续是在反应混合物中存在大量难以去除的副产品。更具体来说，在人体胰岛素原转化为人体胰岛素中，形成大量脱苏氨酸（B30）人体胰岛素〔Des-Thr（B30）-hI〕（约4～6%）。这种由于不带单个末端氨基酸而有别于人体胰岛素的副产物，即使真能从反应混合物中分离出来，其分离方法是困难而麻烦的。

随着重组DNA技术的出现，使首次人工合成大量胰岛素原成为现实。在生产胰岛素使用人体胰岛素原作为中间产物时Des-Thr（B30）-hI杂质问题必需解决，人们或是寻求从污染的Des-Thr（B30）-hI中使人体胰岛素纯化的方法或是寻求在转化方法中将Des-Thr（B30）-hI的形成减到最少的条件。本发明指引使人体胰岛素前体转化为有极少的Des-Thr（B30）-hI形成的人体胰岛素的一种新方法。

因此，本发明目的在于提供使人体胰岛素前体转化为人体胰岛素的方法。这种前体具有下面的化学式：

式中R是氢、用化学或酶促法可切割的氨基酸残基，或者用化学或酶促法可切割的至少带有两个氨基酸残基的肽部分;

R₁是OH、Arg-Y，或Lys-Y，其中Y是OH、氨基酸残基，或者至少含有两个氨基酸残基的肽部分;从A-1至A-21部分是人体胰岛素A链;从B-1至B-30部分是人体胰岛素B链;以及X是胰岛素A-链上A-1的氨基与胰岛素B链上B-30的羧基之间相互连接的部分，这部分可被酶促地从A-链和B-链上裂下而不破坏A链和B链，它包括在水介质中用胰蛋白酶和羧肽酶B处理这种人体胰岛素前体，在该水介质中每摩尔人体胰岛素前体约有0.1至10摩尔的一种或多种金属离子，这些金属具有原子序数21至34、39至52、57至84和89至92。

正如所指出的，本发明的方法显示出增强了公认的用胰蛋白酶和羧肽酶B将胰岛素原转化为胰岛素的作用。该方法用于上述化学式的人体胰岛素前体。尤以人体胰岛素原本身为最佳。

本文所用的“人体胰岛素前体”一词是指下述分子：（1）含人体胰岛素A链和人体胰岛素B链，（2）至少具有通过分别在A-链和B-链上的（a）A-6和A-11，（b）A-7和B-7（c）A-20和B-19上的每个Cys部分的硫相连接的三个二硫键，以及（3）具有与胰岛素A链的A-1氨基与胰岛素B链的B-30羧基连接的可除去连接部分。

R是氢、氨基酸残基，或至少具有两个氨基酸残基的肽部分。其中在R是氨基酸残基或肽部分的情况下，R是可从没有损失残余胰岛素完整结构的胰岛素前体产物切割的基。众多氨基酸残基或肽部分之任一种都限制在基团R的定义范围内。可切割的氨基酸残基的实例是碱性氨基酸，如精氨酸（Arg）或赖氨酸（Lys）及由这些氨基酸残基的羧基终止的肽部分。这些氨基酸残基被公认为在用蛋白水解酶胰蛋白酶处理时易于被切下。可切割的氨基酸残基的又一实例是蛋酸（Met），还有在其羧基末端具有Met的肽部分。通过用溴化氰处理可去除这些残基。再一实例是色氨酸（Trp）或在其羧基末端含Trp的肽部分。用N-溴丁二酰亚胺处理，可去除这种残基。

基团R₁是羟基、精氨酸、赖氨酸或在氨基末端具有精氨酸或赖氨酸的肽。当R₁是精氨酸、赖氨酸、或在氨基末端具有的任何一个这些残基的肽时，在本发明方法的条件下，氨基酸或肽。会被切下同时形成R₁是羟基的产物。

胰岛素前体的连接部分X可以是各种结构之任一种，以X部分是多肽为最佳。多肽一般至少有2个氨基酸残基，更好为约2至35个氨基酸残基，以约6至35个氨基酸残基为最佳。X部分与A链上A-1的氨基和与B链上B-30的羧基相连接。最佳情况是当连接部分X是肽时，是人体胰岛素原的天然连接肽，这种连接肽具有下述化学式：