[发明专利]圆球杆菌的bioA，bioD，bioF，bioC，bioH基因的克隆、载体和转化细胞以及生物素的制备方法

说明书

本发明涉及采用DNA重组体的技术，通过发酵制备生物素。

生物素对于人类，动物，植物和某些微生物来说，是一个必需的维生素。

它可从蛋黄中分离出来，并可以以游离形式或与蛋白质结合的形式存在于啤酒酵母，谷物和各种器官中。

该维生素作为皮肤代谢的调节剂，可治疗脂溢性皮炎。

除了前述的各种来源外，可用某些微生物合成生物素，尤其是用杆菌属的微生物，例如圆球杆菌合成之。

图1表示了在这类微生物中从庚二酸开始的生物素的生物合成链。这种生物合成链包括了不同的五个酶反应，其中起作用的基因分别相继是bioc，bioF，bioA，bioD和bioB。

对工业发酵过程中的从庚二酸开始的生产生物素的系统性的研究，已显示出：某些微生物，尤其是属于圆球杆菌属的微生物能够超生产（hyperproduisent）生物素和生物素的同效维生素（人们称“同效维生素”（“Vitamères”）是指能导致生成生物素的各种中间体）。

对于这些细菌，在一些生物素的前驱当中，DTB（脱硫生物素）代表了主导成分。它是大量地，而且比最终成分，即生物素，还要多的量被生产出来的。

实际上存在一种强烈的抑制生物素合成的转录控制，它取决于在培养基中生物素的量，这种阻遏出现在E.Coli（大肠杆菌）和圆球杆菌（Bacillus    sphaericus）中（下称球杆菌）。

然而，在E.Coli中每一个反馈抑制都不调节生物素的合成，而且这种控制也从来没有在球杆菌中描述过。

要对在球杆菌中从庚二酸开始的大量DTB（相对于较少量的生物素）的生产作出完整的解释还必需进行十分重要的生物学上分子结构的研究，以及在这种细菌中生物素合成途径的调节的研究。

初步的研究表明，某些从能生成DTB的球杆菌菌株（Souches）开始的，生物合成的提取物的和半净制的酶，与已知的在E.Coli中的生物素的酶进行比较，并不显示出明显的差别。

然而，通过这种球杆菌菌株的工业发酵生产生物素（IFO3525，NCLB9370），如果其生物素产率有所改进，则可以与现有的化学方法相匹敌。为了达到这个目的，则应使在这些菌株中所有生物合成生物素的基因都取得超表达（hyperexpression）。

当然，人们已经叙述过对去抑制的（déréprimées）E.Coli菌株的选择，或是通过其耐生物素的类似物，如α-脱氢生物素的作用，或是通过选择生物素的超分泌作用的突变体实施之。同样地，也叙述过“顺式支配”（“Cis    dominantes”）的突变，而这种突变在使所有的生物素基因被构成双极性操纵子的合成过程中起了多效作用。同样也叙述过反式的突变，除了其消除生物素的基因的转录控制的能力外，还常常具有多效作用的性质，即能在细胞的生理学方面起反响。

如果假设在球杆菌菌株中（Souches）生物素生物合成的分子控制和生物素的基因的总结构与E.Coli中的情况相同。那么，传统的微生物的选择方法也将适用于能生产DTB的球杆菌菌株中。

在所有这些假设中，在大量的工业发酵中和连续的培养中采用突变体菌株时，就需要选择一些回复突变率很小的突变体。这就造成了一个难题，即在实际上缺乏在球杆菌中的精细的基因分析方法。

另有方法可以包括克隆（Cloner）所有的能生成DTB的从球杆菌菌株开始的生物素的生物合成链的基因。然后，在试管内修饰控制区域中的5′以便消除转录控制。

而且，用已知的基因工程技术，特别采用已知在球杆菌菌株中起作用的强的启动子，在活体外进行操作对这些基因进行克隆能探讨它们的一般结构，而且能改进它们在活体内的转录。

能够通过采用已知的转化，转导或结合迁移等技术，实施所有这些超表达（hyperexprimés）基因的再引入（réintroduct-ion），这些基因在球杆菌原始菌株中不再受生物素控制了（但是当提高温度或采用不太费钱的基质（Substrat）时会因此受影响而受到诱导控制）。

同样地，可以把这些基因引入到在食品工业中可以接受的，而且能经受庚二酸影响的许多不同的微生物中去，例如，枯草杆菌，麦酒的酶母属，或者假单胞菌属等菌株。

正如在法国专利8412598中所叙述的那样，可以通过质粒的自体选择（autosélection）或者通过在染色体中的整合作用在这些微生物中实现基因信息的稳定。