[其他]由重组体棒状病毒感染的昆虫细胞中的人类免疫缺陷病毒的壳膜基因得到的多肽

说明书

获得性免疫缺陷综合症（爱滋病）是一种有全球重要性的病毒性疾病。这种疾病的病原因子是称为人类免疫缺陷病毒（HIV）的棒状病毒，也有人称之为淋巴结病病毒（LAV）（Barre-Sinoussi等，1983年）、人类T细胞白血病Ⅲ型病毒（HTLV-Ⅲ）（Popovic等，1984）或爱滋病相关病毒（ARV）（Levy等，1984）。根据分子克隆的完全核苷酸序列以及病毒蛋白的直接序列的分析，已阐明了几种爱滋病病毒的结构和基因组织。

在发展爱滋病疫苗和诊断技术中，壳膜蛋白是最有希望的候选物（Francis等，1985）。在爱滋病病人血清中通常检测到抗壳膜糖蛋白抗体（Robey等，1985）。此外，壳膜糖蛋白代表了爱滋病病毒的主要靶抗原（Barin等，1985）。

爱滋病有效的疫苗的生产取决于大量制造安全抗原的能力。这种安全抗原在注入人体时即可刺激机体的保护性免疫力，因为已发现DNA重组技术可以大量制造安全而经济的免疫原，故其代表了抗原生产的最佳选择。选择使用哪一种重组系统（细菌、酵母或其它真核细胞）将考虑以下方面：

可通过糖基化作用和裂解对HIV的壳膜糖蛋白进行特异性加工处理。该重组系统应能以预期的方式加工基因产物。

细菌和酵母细胞不能有效地糖基化它们的表达蛋白质。

虽然哺乳动物细胞似乎是适宜的表达载体，但它们却有包含许多不需要的免疫反应性抗原的缺点，而且还存在着掩匿外来因子的危险。

棒状病毒表达系统提供了生产有效的HIV壳膜免疫原的一个有吸引力和可行的机会。

棒状病毒可被用作在培养的昆虫细胞中生产重组蛋白的高效真核克隆和表达载体。

棒状病毒不止具有用作真核克隆和表达载体所必须的各种条件，它们由于狭窄的宿主范围-只限于节肢动物，所以很安全;它们能够容纳大量的外源DNA;它们的细胞培养物系统是安全的、非转化的和有效的;它们具有高度有效的多角体启动子（polyhedrin    promoter），它比病毒感染的真核细胞中任何其他已知启动子有更大的活性。

棒状病毒系统在生产用于诊断程序的多肽方面也有很大优越性。许多人体和动物一般都具有对细菌、酵母及外源组织相容性抗原起作用的抗体，由于这些抗体与各个表达系统中产生的制剂内的污染细胞、酵母和哺乳动物细胞蛋白质产生假阳性反应，所以它们的存在会降低诊断方法的可靠性。然而，人类和动物不大可能有与鳞翅动物细胞或棒状病毒抗原产生免疫接触的既往史。因此，在这种系统内生产重组蛋白质，使用鳞翅目动物细胞和棒状病毒很可能没有可被正常存在于人或动物体内的抗体识别的污染抗原问题。所以说，在诊断方法中使用由该系统生产的重组抗原时，不会因鳞翅目动物细胞源或棒状病毒源的污染物导致假阳性反应。

本发明的一个实施方案中使用了棒状病毒Autographa    californica核多角体病毒（AcMNPV）。用于表达的启动子序列为得自该病毒的多角体（OCC）基因的启动子序列。AcMNPV和重组体病毒材料在Spodoptera frugiperda（草地贪夜蛾）细胞中维持。所构建的重组体应将Pn基因删除，这样就使得重组体病毒为OCC^-。从而便能根据噬菌斑形态来容易地鉴定重组体病毒，一经分离了重组体棒状病毒，即可用于感染任何一个作为培养细胞系或一个完整昆虫的一部分而保留的受纳或半受纳细胞群体。

插入载体的构建

外来蛋白质编码序列在棒状病毒载体中的克隆和表达，要求该编码序列与多角体启动子和上游序列连成一线，而且在另一侧与截短了的多角体编码序列连成一线，结果使得与棒状病毒基因组的同系重组导致与多角体启动子和失活的多角体基因连成一线的外来编码序列的转移。

因此，设计了各种用于爱滋病env基因构建的插入载体。下述的每种插入载体用来提供ATG转译起始密码子，外来序列向这些载体内的插入必须设计成能维持由起始密码子确定的转译读码正确地通过外来序列。

以下的参考附图对本发明的实施进行了详细描述。

图1为LAV-1a分离物之全长壳膜基因的核苷酸序列，同时给出了推定的氨基酸序列。序列资料得自于GENBANK。核苷酸的编号是由假定的ATG起始密码子的第一个核苷酸开始的。氨基酸是从ATG起始密码子编号的。图中显示了相应于信号肽细胞外糖蛋白（gp120）及跨膜糖蛋白（gp41）的区域，连同提出的肽裂解位点及天冬酰胺联系的糖基化位点。在核苷酸序列的下面列出了适当的限制性酶切点。