[其他]采用杂交测定人体T细胞白血病病毒I和II

说明书

本发明涉及一种测定病毒中的核苷酸顺序是否存在的方法，该病毒涉及人体T细胞白血病病毒Ⅰ型和Ⅱ型（HTLVⅠ和Ⅱ）。本发明还涉及一种用于在引物和标记的杂交探针存在下的这样测定的装置。

人们已知道，某些T细胞肿瘤的发病机理中涉及到一族T细胞热带还原病毒，称为人体T细胞白血病病毒（HTLV）。目前，已知道有三种类型的HTLV。第一，Ⅰ型（HTLVⅠ）是一种肿瘤病毒，它和在日本、加勒比海地区和非洲所发现的人类成年人T细胞白血病淋巴细胞瘤（ATLL）有密切的联系。第二，Ⅱ型（HTLVⅡ）是一种肿瘤病毒，它是从具有毛发状细胞白血病的T细胞变株的两个病人中分离出来的。参见M.Popovic等，《Science》224卷497～500页（1984）和Rosenblatt，J.D等，New    Eng.J.of    Med.，8月号（1986）。第三，Ⅲ型（HTLVⅢ）是一种慢病毒，是一种引起艾滋病（AIDS）的病原体，艾滋病是一种会传染的细胞免疫系统的疾病，会引起常是致命的感染。

用对付HTLV相关病毒，如艾滋病的抗体鉴定血清的免疫诊断试验（参见美国专利第4，520，113号，Gallo等）正在血库中被用于排除潜在感染的血液。也可参见WO86/01834，1986年3月27日公布（加利福尼亚大学），它是用在制备单克隆抗体中有用的还原病毒多肽去测定HTLV族中的还原病毒。因为这种病毒属于一种不产生有效数量病毒颗粒的DNA复制品，一种测定HTLVⅠ和Ⅱ型有关的病毒的直接免疫方法用于很大部分的无征状个体持久感染被证明是不成功的。因为在感染组织和血液中病毒颗粒的数量可能是很少的（因为病毒的休眠），病毒颗粒或RNA/DNA的直接测定可能是相当困难的，如果不是办不到的话，不要把感染细胞与合适的T细胞系进行共同培养。

美国专利第4，683，202号（1987年7月28日公布）中，K.Mullis描述了一种通过采用一种标记的RNA或DNA杂交探针放大核酸顺序以促进测定的方法。在这个方法中，引物被用于得到引物延长产物，该延长产物用作核苷酸存在下合成附加的互补链的模板。该专利申请案中也描述了一种技术，即：在探针被杂交至所需要的顺序上以后，再加上一种限制性内切酶以使在所需要的顺序内的某一位置上裂解杂化物，然后对限制性消化进行分析以了解标记片断。美国专利第4，683，194（1987年7月28日公布），以及《生物技术》第3卷1008～1012页（1985）中H.Erlich等和Saiki等写的文章中，更详细地描述了这一后种技术。两个专利申请案中都列举了测定遗传病，如镰状细胞贪血和β-地中海贪血症的方法的应用。这些方法和用于扩增核酸顺序的方法在《Science》第230卷。1350～1354页（1985）中，Saiki等著的文章中也揭示过。

《Clin.Lab.Med》（1985）第五期。513～529页上Landry等写的综述文章中描述了核酸杂交领域用于病毒测定。WO86/01535（1986年3月13日公告）和欧洲专利173，529号（1986年3月5日公告）中都揭示3HTLVⅢ的分子的克隆和利用克隆作为探针测定艾滋病。更进一步地，欧洲专利公告173，339号（1986年3月5日公告）中，揭示了用DNA探针测定被外来微生物感染的遗传分析。欧洲专利185，444号（1986年6月25日公告）中，揭示了一种重组肽作为探针用于测定细胞溶解产物中的HTLVⅢ病毒。翁苏公司（Qncor    Inc.）在1986年9月宣布它发展了一种放射血液试验测定艾滋病毒。

用于测定肿瘤病毒HTLVⅠ和Ⅱ的杂交探针可能鉴定被持久感染，但不产生病毒的那些个人，也可能鉴定抗体阴性，但培养物阳性的个人，而且测定感染的细胞不需要培养病毒。用扩增法增加病毒的核酸的复制数将有利于鉴定在被感染个体中病毒的核酸。

本发明包括一种测定或检验核酸顺序是否存在的方法，所述核酸顺序是指大量存在于HTLVⅠ或HTLVⅡ核酸的分离体中，或大量存在于HTLVⅠ和HTLVⅡ核酸两者的分离体中，这种方法对于测定HTLVⅠ或HTLVⅡ的核酸或HTLV和HTLVⅡ两者分离体中的核酸是特别有效的，该方法包括：

（a）.用核酸顺序的每条链的寡核苷酸引物、四种不同的核苷三磷酸和一种聚合作用剂在杂交条件下，一起或分别处理样品，对核苷顺序的每条链，合成每个引物的延长物，它是与每条核酸链互补的，其中所说的引物基本上与待测定或检验的核酸顺序的每一链互补，以每一个引物合成的延长物，当它从它的补体中分离时，可作为其他引物的延长产物合成的模板;