[发明专利]T7脱氧核糖酸聚合酶

权利要求书

1、一种测定DNA分子的塑账峒罨承虻姆椒ǎǎ?

使所述DNA分子与能与所述DNA分子杂交的引物分子退火；

在至少四个容器中分别保温退火混合物的各部分，每个容器中含有四种不同的脱氧核苷三磷酸；一种连续性DNA聚合酶，其中，所述聚合酶与所述DNA分子维持结合状态至少达500个碱基，然后在DNA测序反应的延长反应通常所用的环境条件下解离，所述聚合酶的核酸外切酶活性少于每毫克所述聚合酶500单位；以及四种DNA合成终止剂中的一种，它在特定的核苷酸碱基位点终止DNA合成，其中每一种所述终止剂在不同的核苷酸碱基处终止DNA合成；

根据大小分离每个保温反应液中的DNA产物，通过这种方法，至少能够确定所述DNA分子的部分核苷酸碱基顺序。

2、权利要求1的方法，其中所述聚合酶与所述DNA分子维持结合状态至少达500个碱基后才解离。

3、权利要求1的方法，其中所述聚合酶与所述DNA分子维持结合状态至少达1000个碱基后才解离。

4、权利要求1的方法，其中所述聚合酶是用T7-型噬菌体感染的细胞中的聚合酶。

5、权利要求4的方法，其中所述的T7-型噬菌体是T7、T3、φⅠ、φⅡ、H、W31、gh-1、Y、A1122或SP6。

6、权利要求1的方法，其中所述聚合酶是不区分双脱氧核苷酸类似物的。

7、权利要求1的方法，其中所述聚合酶是修饰过的聚合酶，每毫克聚合酶的核酸外切酶活性少于50单位。

8、权利要求7的方法，其中所述修饰的聚合酶的核酸外切酶活性小于每毫克聚合酶1单位。

9、权利要求7的方法，其中所述修饰的聚合酶的核酸外切酶活性小于每毫克聚合酶0.1单位。

10、权利要求1的方法，其中所述聚合酶没有可测的核酸外切酶活性。

11、权利要求1的方法，其中所述聚合酶能够利用10碱基对或更多碱基对的引物。

12、权利要求1的方法，其中所述聚合酶能够利用4碱基对或更多碱基对的引物。

13、权利要求1的方法，其中所述引物包括4-20碱基对，所述聚合酶能够利用4-20碱基对的引物。

14、权利要求4的方法，其中所述聚合酶不区分核苷酸类似物，它是一种修饰的聚合酶，每毫克聚合酶的核酸外切酶活性小于500单位，

所述引物是含有4-10个碱基的单链RNA或DNA，所述聚合酶能够利用4-10个碱基的引物，

所述保温过程包括一个脉冲和一个追止步骤。

15、权利要求1的方法，其中所述引物是单链DNA或RNA。

16、权利要求1的方法，其中所述退火步骤包括使所述DNA分子和所述引物加热到65℃以上，并使加热混合物冷却至0℃-30℃。

17、权利要求1的方法，其中所述保温过程包括一个脉冲和一个追止步骤。

18、权利要求17的方法，其中所述的脉冲步骤包括使所述的退火混合物与所有四种脱氧核苷三磷酸和一种连续性DNA聚合酶混合，其中至少一种所述脱氧核苷三磷酸具有标记并以有限浓度存在。

19、权利要求18的方法，其中所述脉冲步骤的保温进行30秒至20分钟。

20、权利要求18的方法，其中所述追止步骤包括在进行了所述脉冲步骤后，在四等份混合物中分别加入一种所述链终止剂。

21、权利要求20的方法，其中所述追止步骤的保温进行1至60分钟。

22、权利要求1的方法，其中所述终止剂是双脱氧核苷酸。

23、权利要求1的方法，其中所述终止剂是一种有限水平的脱氧核苷三磷酸。

24、权利要求1的方法，其中一种所述脱氧核苷三磷酸从dITP或脱氮鸟苷中选择。

25、权利要求1的方法，其中所述引物在所述退火步骤前进行标记。

26、权利要求25的方法，其中所述保温过程包括一个追止步骤。

27、权利要求25的方法，其中所述引物是荧光标记的。