[发明专利]T7脱氧核糖酸聚合酶

说明书

本发明涉及适用于DNA顺序的DNA聚合酶。

DNA顺序测定涉及四种单链DNA片段的形成，每一条链具有一个确定的末端和一个可变的末端。可变末端总是终止于某一给定的特异核苷酸碱基（鸟嘌呤（G）、腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）或胞嘧啶（C）中任一种）。四套不同的片段根据其长度在高分辨率的聚丙烯酰胺凝胶上分离;凝胶上的每一条带，线性地对应于DNA顺序中的某一特异核苷酸，这样可鉴别出特定核苷酸碱基在顺序中的位置。

一般说来，有两种测定DNA顺序的方法。一种方法（Maxam和Gilbert测定法）涉及DNA分离片段的化学降解，每一条链在其确定的末端用单一放射性标记进行标记，每一反应专一于四种碱基中（G、A、T或C）的一种或多种而进行有限的切割。另一种方法（双脱氧测序法）涉及DNA链的酶促合成。分别进行四种合成，每一反应通过加入合适的链终止双脱氧核苷酸而终止于某一特定碱基（G、A、T或C）。后一种方法较为优越，因为DNA片段被均一标记（而不是末端标记），因此较大的DNA片段含有逐步增加的放射性强度。并且，可用³⁵S-标记的核苷酸代替³²P-标记的核苷酸，使结果更为清晰;由于每一泳带只对应于G、A、T或C中的任一种，因此，很容易阐明反应产物。大多数双脱氧测序法所用的酶是大肠杆菌（Escherichia coli）DNA聚合酶Ⅰ大片段（“Klenow”）。所用另一种聚合酶是AMV逆转录酶。

在一个方面，本发明的牲是一种测定DNA分子中核苷酸碱基顺序的方法，包括使DNA分子与能与此DNA分子杂交的引物分子退火;使退火混合物分成几份后至少在四个容器中保温，这四个容器中含有：四种不同的脱氧核苷三磷酸;一种连续性DNA聚合酶，该聚合酶在DNA测序反应的延长反应通常所用的环境条件下，可在它与DNA解离之前，与DNA维持结合状态至少达到500碱基，聚合酶的核酸外切酶活性为每毫克酶小于500单位;以及四种DNA合成终止试剂中的一种，它在特异的核苷酸碱基处终止DNA合成。四个容器中的试剂分别在不同的特异核苷酸碱基处终止。保温反应的DNA产物根据其大小分离，这样，至少能测出DNA分子的部分核苷酸碱基顺序。

在较好的具体方案中，聚合酶与DNA分子在解离前保持结合至少达1000碱基;该聚合酶实质上与用T7-型噬菌体（即其中DNA聚合酶需要宿主的硫氧还蛋白作为一个亚基的噬菌体;例如，T7-型噬菌体是T7、T3、φⅠ、φⅡ、H、W31、gh-1、Y、A1122或SP6，Studier，Virology    95：70，1979）;感染的细胞中的聚合酶相同;该聚合酶不能区分双脱氧核苷酸类似物;该聚合酶被修饰，使每毫克聚合酶的核酸外切酶活性小于50单位，更好是小于1单位，进一步更好是小于0.1单位，最好是检测不出核酸外切酶活性;聚合酶能够利用短至10个碱基或更好是短至4个碱基的引物;引物含有4至40个核苷酸碱基，并且是单链DNA或RNA;退火步骤包括使DNA分子和引物加热至65℃以上，最好是65℃至100℃，使加热后的混合物冷却至65℃以下，最好是0℃至30℃;保温步骤包括一个脉冲步骤和一个追止步骤，其中脉冲步骤包括使退火混合物与所有四种不同的脱氧核苷三磷酸和一种连续性DNA聚合酶混合，其中至少有一种脱氧核苷三磷酸是标记的;脱冲步骤最好在聚合酶不表现其连续性的条件下进行，在0℃至20℃进行30秒至20分钟，或者至少限制一种三磷酸核苷;追止步骤包括在四份等分量的脉冲步骤后的混合物中分别加入一种链终止试剂;追止步骤最好是在30℃至50℃下进行1至60分钟;终止试剂是双脱氧核苷酸，或一种有限量的脱氧核苷三磷酸;四种脱氧核苷酸中的一种是dITP或脱氮鸟苷，使用标记引物可免去脉冲步骤，标记最好是放射性或荧光标记;在DNA顺序反应的脉冲反应通常所用的第二环境条件下，聚合酶不能表现其连续性。