[其他]与结合蛋白相融合的蛋白质的生产及纯化

说明书

本发明涉及利用DNA重组技术生产和/或纯化几乎所有的杂交多肽或融合的蛋白质分子的方法。更具体地说，编码一种蛋白质分子（如一种多肽或其一部分）的DNA片段与编码一种结合蛋白的DNA片段（例如编码麦芽糖结合蛋白的基因）相融合。将融合的DNA插入一个克隆载体中，以此转化一种合适的宿主。表达以后，产生一种杂交多肽或融合的蛋白质分子，可通过使杂交多肽与结合蛋白对其具有专一亲和性的配体或底物接触而进行纯化，例如通过亲和层析纯化。在某些情况下，这样纯化的杂交多肽可以其杂交形式使用，或也可以进行切割以得到蛋白质分子本身，例如，将编码蛋白质分子和结合蛋白的DNA片段与编码一种肽的DNA片段相连接，这种肽能由一种蛋白水解酶识别和切割。本发明还涉及用以实施上述方法的某些载体，以及生物反应器和利用结合的杂交多肽的方法，例如使结合的融合多肽与一种底物接触并反应，该底物能与结合的蛋白质分子相互作用产生预期的效果。

近来发展的技术已能够利用能迅速而大量生长的微生物来合成商业上有用的蛋白质和肽。利用这些技术，能够使一种合适的微生物具有合成通常由其他生物生产的蛋白质或肽的能力。简言之，使编码蛋白质的DNA片段连接到克隆载体如质粒中。用克隆载体转化合适的宿主，鉴定、分离和培养转化宿主，以启动所需蛋白质的表达。然后从培养基中分离如此产生的蛋白质并进行纯化。

已有多种纯化技术被用来收集由DNA重组技术产生的蛋白质。这些技术通常包括根据分子的不同性质分离所需蛋白质，例如，通过透析、密度梯度离心和液相柱层析法分离。这些技术没有普遍的适用性，并通常要消耗比待纯化的蛋白质贵重得多的纯化物质，在需要大量高度纯化的蛋白质时更是如此。

根据蛋白质的溶解度特性，发展了其他一些方法以纯化蛋白质。例如，业已采用等电点沉淀纯化蛋白质，因为蛋白质的溶解度作为pH的函数而变化。同样，蛋白质的溶剂分级分离技术是基于蛋白质的溶解度作为基质介电常数的函数而变化。溶剂分级分离法虽然产率不错，但通常导致蛋白质分子的变性。等电沉淀和溶剂分级分离都不能用来制取高度纯化的蛋白质。这些技术一般都是与其他方法结合使用。

亦已根据离子性质分离蛋白质，例如利用电泳、离子交换层析等。但这些电泳技术一直是作为分析手段使用的，不适于作为大规模纯化蛋白质的方法。而且，在这种技术中，很难通过单个步骤就得到高度纯化的高产率蛋白质。

亲和层析也被用来纯化生物聚合物如蛋白质。亲和层析涉及一种选择性吸附剂，使它与含有几种物质（包括待纯化的所需分子在内）的溶液接触。例如，当用于蛋白质纯化时，亲和层析一般使用一种与待纯化的蛋白质专一结合的配体。一般使配体偶联或连接于载体或基质上，再使偶联配体与含有杂蛋白的溶液接触。通过洗涤除去未结合的分子，通过用专一性解吸附剂进行洗脱回收所需蛋白质。亲和层析虽然能产生较高水平的纯化蛋白，但此技术需要大量专一于蛋白的配体用于纯化。而且，每一种待纯化的蛋白质需要不同的配体，这必然使得纯化过程既耗时又费力。此外，还发现并不是对于所有类型的蛋白质分子（例如某些酶类）都存在有专一性配体。其结果是，亲和层析法并未被成功地用作普遍适用的蛋白质分子的分离纯化技术。

0，150，126号欧洲专利申请（Hopp）描述了一种使亲和层析普遍适用于所有蛋白质的方法。公开了制备通过DNA重组技术使基因融合而产生的杂交分子的方法。一个基因编码待纯化的所需蛋白，而另一个基因则编码一个鉴别或标记肽。标记肽含有一个具有高度抗原性的N-末端部分（以此制备抗体），以及一个使标记肽和待纯化蛋白质连接的连接部分。利用专一性的蛋白水解剂，可将标记肽的连接部分在邻接待纯化蛋白质的专一氨基酸残基处切断。用专一于标记肽中抗原部分的固定化抗体建立亲和柱，分离融合或杂交的蛋白质。抗体与融合蛋白质结合，然后，后者可用解吸附剂从柱中释放。然后，利用蛋白水解剂可将标记肽从所需的蛋白质分子上切下。

Hopp的方法虽然试图克服上述蛋白纯化方法中的某些问题，但该方法需要大量专一于标记肽抗原部分的抗体。而且，释放靶蛋白所需的解吸附剂（在该例中是一种小肽）的量很大，也是耗费很大的一个因素。另外，还必须从靶蛋白中通过纯化去掉解吸附剂。因此，使此系统扩大规模不是切实可行的。进一步，层析柱的再生可能极为困难，因为使用后洗涤柱子所用的条件是不稳定的，它实际上会破坏层析柱。另外有人提议使用低亲和性的抗体柱。然而，低亲和柱常导致非专一性结合，这对于任何大规模纯化来说都需要大量费用。