[其他]病毒抗原，其制备方法及在诊断和治疗中的应用(疫苗)

说明书

文献中有许多关于非甲非乙型肝炎的充分介绍。同时，分离非甲非乙型肝炎（HnAnB）病毒以及对这些疾病进行正确诊断的困难也是众所周知的。

从非甲非乙型肝炎患者的粪便中，我们可分离出病毒颗粒，通过其分子量和物理性质来表征它们，并发展一种检测这种颗粒的方法。我们也可通过检测这些颗粒以诊断肝病病人的非甲非乙型肝炎的存在。

从用粪便制取的颗粒中分离DNA，并用常规方法进行克隆。再用这样得到的DNA检测肝病病人的粪便、血清、肝组织以及体液中的同源DNA或与此非常类似的DNA。通过这种方法，可以足够的确定性诊断非甲非乙型肝炎的存在。

总之，本发明涉及非甲非乙型肝炎颗粒相关的DNA的分离和克隆，从而用这些颗粒以及由此克隆的DNA来确诊肝病中非甲非乙型肝炎的存在。本发明更进一步的目的涉及研究更为普遍适用的检测方法，并根据抗这些颗粒的抗体、具有相应于病毒颗粒蛋白质顺序的合成肽（病毒蛋白顺序由克隆的DNA核苷酸顺序推测出），最终发展出抗非甲非乙型肝炎的疫苗。

从非甲非乙型肝炎病人的粪便中分离出一种物质，发现它在这种非甲非乙型肝炎病人的粪便中的出现率明显增高，而由其他原因引起的肝疾病的肝炎中，出现率则明显下降。研究出一种检测这种物质的方法，即将聚苯乙烯小球用康复期非甲非乙型肝炎病人的预稀释血清涂布，然后洗涤小球，与待测病人的10%粪便悬浮液保温，从而使粪便中存在的非甲非乙型肝炎相关的物质结合到这种物质的抗体上，从而吸附在聚苯乙烯小球上，并将其固定在上面。非甲非乙型肝炎相关颗粒的结合可通过人的IgG结合检测，此IgG也由康复期非甲非乙型肝炎病人的血清制取，并用放射性碘¹²⁵加以标记。放射性标记的免疫球蛋白结合到病人粪便中非甲非乙型肝炎相关的物质上（如果有的话），所得到的信号能用于颗粒的检测。

用这种方法检测各种病因引起的多种肝病病人的非甲非乙型肝炎相关的物质，结果表明，确定患有非甲非乙型肝炎病人的粪便中的出现率明显上升（见表1）。在其他类型的肝病病人中（即病因不大可能是非甲非乙型肝炎的病人，但其临床表现类似于急性非甲非乙型肝炎或康复期的非甲非乙型肝炎），只在极少数的情况下发现上述物质（表2和表3）。这些发现证明，非甲非乙型肝炎相关物质的存在是任何最初未知的传染性肝病病因的明确指示。此外，这类物质的检测可作为有效的诊断测试，以检查病人是否患有非甲非乙型肝炎。

非甲非乙型肝炎相关的物质对人类免疫球蛋白以及纤维结合素（fibronectin）及其非胶原连接的断裂产物具有高亲和性。

与健康家族以及非甲非乙型肝炎病人的IgG的f（ab）₂相结合时，非甲非乙型肝炎相关的物质不大可能非专一性地连接到IgG的Fc部分。它对纤维结合素及其非胶原连接的断裂产物的高亲和性是与其他抗原病毒蛋白质共有的性质（参阅Seeling等，1983）。用有机溶剂（例如氯仿和乙醚）加热（70℃、10分钟）处理，不能破坏非甲非乙型肝炎相关物质的结合亲和力。当用胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、弹性蛋白酶以及神经氨酸苷酶消化时，对该物质的结合亲亲和力无影响;用木瓜蛋白酶消化则导致这种结合亲和力迅速地完全失去。

在以150，000×g离心两小时后，可在沉淀中检测到此物质，在密度为1.3（1.29～1.32）g/ml的氯化铯梯度上离心72小时也能发现此物质。通过在聚丙烯酰胺梯度凝胶上的电泳，分离密度为1.30g/ml的氯化铯带，并且，凝胶的银染色呈现出相应于各种分子量的多个带。转移到硝化纤维素上以后，用非甲非乙型肝炎病人和健康供体得到的放射性标记的IgG和F（ab）₂片段进行Western印迹测定，呈现出在健康对照者的粪便提取物中没有发现的带。总之，可以见到四个带，即2个分子量分别相应于约64000和56000的主带和2个分子量分别相应于约51000和43000的次带。用F（ab）₂片段获得的带强度较低，并呈现较高的本底。通过SDS-PAGE电泳对粗粪便浓缩物进行分析和印迹测定，阳性粪便样品中呈现出2个分子量约60000的主带。