[发明专利]酸性蛋白酶的纯化方法

说明书

本发明涉及可用作抗炎剂的酸性蛋白酶的纯化方法。

赛氏肽酶（类名）是由某些微生物产生的带有特性金属锌的酸性蛋白酶，由于它具有强烈的抗炎活性，所以已被广泛使用，例如用作抗炎药物。

赛氏肽酶的制备步骤通常包括培养，分离细胞，和纯化。

在从产生赛氏肽酶微生物的肉汤培养液中分离细菌细胞的常规方法中，将盐（如硫酸钠，硫酸铵或类似物）加到培养肉汤中使细胞絮凝，然后用离心机或借助于助滤剂（如硅藻土）加压过滤除去生成的絮凝物。

由于赛氏肽酶的不稳定性，所以为了纯化并保持其抗炎活性，一般采用盐析法或用水溶性有机溶剂的分级沉淀法，或二者兼用（美国专利3，691，014号）。

在最近报道的纯化方法中，先在有盐存在的条件下使赛氏肽酶吸附到聚丙烯酸酯非离子型吸附树脂上，然后，用含水有机溶剂（如含水甲醇解吸（洗脱）（公开号为61-215330的日本未审查专利申请）。

对酸性蛋白酶（如赛氏肽酶）迄今已知的纯化方法总是需要大量的物料，如盐，有机溶剂等，也需要大量的劳动和成本，例如回收所用的有机溶剂。此外，收集细沉淀物需要大量的劳动和时间，在各步柱层析的操作中，不能获得足够高的流速。由于这些缺点，所以至今没有提出一种方法可充分满足本身就不稳定的酸性蛋白酶以商业化规模纯化的要求。

还应注意用这些先有技术方法得到的赛氏肽酶产物的比活性（纯度）不够高。

本发明人发现酸性蛋白酶甚至在没有盐的情况下也能够有效地吸附到弱碱性离子交换树脂上并可不用有机溶剂解吸。

发明人还建立了一种方法，其中不用盐就可从培养肉汤中分离出细胞，得到基本上无盐的酸性蛋白酶水溶液，并且发现这样制得的溶液可直接进行纯化。

因此，本发明提供一种纯化酸性蛋白酶的方法，该方法包括用基本上无盐的水使基本上无盐的酸性蛋白酶水溶液与弱碱性离子交换树脂接触并用含有无机盐的水溶液洗脱所吸附的酸性蛋白酶。

在酸性蛋白酶中，可优先提及赛氏肽酶，可用下述方法获得含有赛氏肽酶的水溶液：在培养基中培养赛氏杆菌属的赛氏肽酶产生菌株并从最终的培养肉汤中分离出细菌细胞（美国专利3，691，041号）。

作为赛氏杆菌属的赛氏肽酶产生菌株的一个实例，可提及的是赛氏杆菌SP.E15。该赛氏杆菌SP.E15菌株已于1967年5月15日贮存在美国典型培养物保藏中心（ATCC），登记号为ATCC21074并已编入1982年第15版菌株I的目录。

用薄膜分离法，如微量过滤法（MF），超滤法（UF）或陶瓷过滤法（CF）分离这种菌株的培养肉汤，可直接得到基本上无盐的酸性蛋白酶，如赛氏肽酶的水溶液。特别是MF的应用（孔径大小：约0.05-10μm）使得人们不必借助于加盐就能直接获得无细胞，基本上无盐的赛氏肽酶水溶液。

本文所用的“基本上无盐”一词是指只含有最初存在于培养肉汤中的盐的水溶液，该溶液通常的盐浓度不超过0.1%。从吸附到弱碱性离子交换树脂上的效率看，盐浓度不高于0.05%（w/v）的溶液尤佳。

这种水溶液的赛氏肽酶含量实际上是可任选的，但通常在0.01～10%（w/v）的范围内。该水溶液的pH最好在大约4～9范围内，在该pH范围内赛氏肽酶仍是稳定的。用于洗脱的基本上无盐的水最好是自来水。

弱碱性离子交换树脂（OH-型）是以乙烯基聚合物，苯乙烯聚合物，丙烯酸聚合物，DEAE-纤维素或其类似物为基础并带有弱碱性基团（如一级，二级或四级低级（C_1-4）烷基氨基）或相应的铵盐的离子交换树脂。在实施本发明时，基于乙烯基聚合物并带有弱碱性基团（如二乙基氨基，二乙醇氨基或其类似物）的离子交换树脂使用起来具有特殊的优点。

离子交换树脂最好以直径为0.3～3.0mm的珠粒形式使用。

作为这种弱碱性离子交换树脂的实例，可以提及的有EP-DA13L（Mitsubishi    Chemical    Indu-stries，Ltd.，日本）和Spezym    GDC（Kurita    Water    Industries，Ltd.，日本）。

本发明方法中的吸附是以常规方式进行的，例如，逐柱或逐批进行。该吸附程序在0-30℃的温度下，最好在0-10℃下进行。