[发明专利]活性态蛋白质之生产

说明书

本发明涉及一种生物活性或自然形态蛋白质的制备方法。

重组体DNA(脱氧核糖核酸)技术为合成大量需要的真核生物(通常是哺乳动物)蛋白质提供了极有潜力和价值的手段，这些蛋白质例如有激素、干扰素和酶。虽然已经证明操纵诸如细菌类的有机体来制备所需的蛋白质是比较简易的，但宿主机体可能不把过度生成的蛋白质产物分泌到该培养基中。因此通常就必须使该等有机体(例如细菌)产生物理或化学溶胞作用，随后是以机械法离析出不溶性的目的蛋白质。在已有技术中，然后是采用高浓度的变性剂来进行该不溶性蛋白质的加溶，例如用尿素或盐酸胍的水溶液(国际专利申请WP83/04418)。因此，加溶作用一直是使用得自一种多步骤方法的较纯净形态的目的蛋白质来进行。实施这些方法的投资额高，工业上实施时最好能避免使用此法。

在我们共同提出申请的澳大利亚专利申请66874/86中，申请人描述了应用一种阳离子表面活性剂从一种不溶性蛋白质源中回收一种可溶性形式蛋白质的非常有利、尽管是多步骤但很经济的方法。然而这个方法虽可以有效地回收可溶性形式的蛋白质，活性蛋白质的最后回收率受到限制。例如，其总回收率通常是低于50％。在宿主细胞的收集、它们的溶胞作用以及蛋白质聚集物的提浓中会带来相当大损耗，因此出现了通过物理提浓，包括差速离心在内的方法。

因此，本发明的目的是之一就是要克服或至少是减轻在已有技术中存在的一个或更多个问题。

第一个方案是提供一种回收蛋白质的方法，该方法包括提供一个包含有一种合成的或直接获得的蛋白质的宿主细胞来源；以及至少一种阳离子、阴离子或两性离子表面活性剂来源；并且应用至少一种该等阳离子、阴离子或两性离子表面活性剂，以足以产生加溶效应的量，去处理该等宿主细胞。

该种回收蛋白质的方法最好包括提供一种发酵液，其中包括含有一种合成的或直接获得的蛋白质的宿主细胞，并且从其中离析出该等宿主细胞。该离析步骤可以应用任选适当的方法来进行。可以应用浮选、离心、过滤或超滤法。

对于许多种宿主细胞，该阳离子、阴离子或两性离子表面活性剂还可以具有使这些细胞溶胞的作用。但是，在不能发生这种作用的场合，最好再有一个机械或化学的溶胞步骤。在这种情况下，这种处理是施加于浓缩的、比较不纯的全细胞溶胞产物。

在一个位选的方案中，该宿主细胞可以受到预处理以杀死该细胞或使细胞膜变弱，以便于进行溶胞作用。

在一个优选方案中，按本发明的该回收方法进一步包括以下的同时进行的步骤：

将该等宿主细胞进行溶胞，以形成一种全细胞溶胞产物。

对于如此形成的产物溶液可以应用差速离心、分步沉淀、色谱或过滤法进行提纯。这样将可除掉诸如不溶性的不希望的污染物、不希望的细胞碎片和其他不希望的大分子物质等杂质。

关于该至少一种阳离子、阴离子或两性离子表面活性剂的用量，要求超过它们的临界胶束浓度。

本发明特别适用于由微生物和真核生物细胞系列所合成并经重组体DNA技术改性的具生物重要性的蛋白质的加溶与回收。所需的该种蛋白质可包括在一个宿主细胞中的一种包含体，该宿主细胞可以由一个包括该蛋白质的一个基因密码的一种向量所转换或转染。

按本发明可以回收的蛋白质可以选自于单体式和聚合物式细胞内蛋白质，例如在细胞内含体和细胞质聚集物中所存在的蛋白质。该等包含体可以选自具生物重要性的多肽和肽，包括猪、牛、羊生长激素、干扰素、免疫原以及淋巴细胞活素，或者它们的非均质或均质聚合物。

该至少一种阳离子、阴离子或两性离子表面活性剂的优选含量是约2.5-50％(重量/体积)，最好是2.5-20％(重量/体积)。表面活性剂含量的上限可以变化，并且由所选表面活性剂的溶解度所限。

业已发现，有可能对包括包含体在内的全细胞所制成并含有的目的蛋白质聚集体进行加溶，方法是用一种表面活性剂在水中的溶液处理该细胞及其组分，可以有或没有一种极性有机溶剂存在，或者只用单独的该极性水质溶剂。这个过程可以很快(5-60分钟)，并且很容易回收该加溶的蛋白质并达到最优化的效果。只需用少量廉价并且易于得到的药剂，并且可以循环使用。例如，该加溶剂的主体部分可以是水。