[发明专利]水稻DNA启动子顺序的克隆方法

权利要求书

1、一种由供体DNA及载体DNA经酶切、混合、连接、检测等过程组成的筛选启动子DNA顺序的克隆方法，其特征在于：上述的供体DNA采用水稻总DNA，上述的载体DNA为带有lacZ结构基因的PCH1质粒DNA，其中载体DNA用牛小肠碱性磷酸酯酶处理，DNA供体与载体DNA的混合比为2∶1～5∶1，上述的检测采用含有X-gal的平皿筛选法。

2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：上述的供体DNA采用水稻叶绿体DNA。

3、根据权利要求1所述的方法，其特征在于，上述水稻总DNA的制备过程为：水稻种子用10%～15%的消毒剂（安替福民）消毒10分钟～20分钟，25℃～30℃暗室下培养7～10天后剪下黄化苗上部（ 1/2 - 1/3 苗高），迅速加入液氮，捣碎。在冷冻粉未融之前立即加入提取液（40～50mM Tris-HCl pH8.0～8.5，10～12mM EDTA，0.5～0.7NaCl，1%～1.2%基乙醇，0.8%～1%CTAB）。每克冷冻粉加2～3ml提取液。35℃～37℃水浴保温1～2小时，不时轻轻摇动。保温结束后加入等体积氯仿-异戊醇（24～25：1v/v），轻摇10-15分钟，0℃～4℃下5，000～6，000g离心10-15分钟，吸出水相，再重复两次。水相加入等体积的沉淀缓冲液（40-50mM Tris-HCl，pH8.0～8.5，10-12mM EDTA，1%～1.2%CTAB），室温下静置30～60分钟后用玻棒挑出丝状沉淀，在0.25～0.3M NaAc 70～75%乙醇中浸洗2～3次，并在该溶液中浸过夜。再用95～100%乙醇浸洗两次，抽干乙醇。最后将玻棒上的沉淀物溶于适量的TE溶液中（8～10mM Tris-HCl，1-1.5mM EDTA，pH7.5-8.0）。

4、根据权利要求2所述的方法其特征在于，上述水稻叶绿体DNA的制备过程为：水稻种子用10～15%的消毒剂（安替福民）消毒10～15分钟，25℃～30℃下见光培养。7～10天后剪下绿化苗上部（约三分之二苗高），用清水洗净，称量，加入匀浆液（15～20mM Hepes-Cl pH7.2～7.4，1mM-1.5mM EDTA，0.25-0.3M甘露醇，10mM-15mM KCl，0.1-0.2%BSA），每100克绿化苗用1000～1200毫升匀浆液，匀浆打碎后用纱布过滤，过滤液用9，000～10，000g离心10-15分钟，收集绿色沉淀物，用100-120毫升悬浮液（5-10mMHepes-Cl pH7.2～7.4，1～1.5mM EDTA，0.2～0.25M蔗糖，0.1～0.2%BSA）悬浮沉淀物，9000g-10，000g离心5～10分钟，去沉淀，上清液用5，000-6，000g离心10-15分钟，收集绿色沉淀物，加10-15mlSIP溶液（90-95%Percoll，5～10mMHepes，1～1.5mMEDTA，0.2-0.25M蔗糖，0.1-0.2%BSA），最后用悬浮液补至40-45ml，混匀后5，000～6，000g离心30-45分钟，停机后管子顶部有一绿色叶绿体带出现。小心用吸管吸出，加入DNasel（浓度为5～10μg/μl），使其终浓度为10～20μg/ml，并加入1～1.5M MgCl₂，使其终浓度为10-15mM。置4℃-10℃中1-2小时。用悬浮液稀释，4，000～5，000g离心10-15分钟，收集沉淀，重复两次。纯化后的叶绿体用裂解液（10-15mMTris-Cl，pH8.0-8.5 10-15mMEDTA，200-250mMNaCl，1-2%Sarkosyl）加蛋白酶K至终浓度50～100μg/ml，35℃～37℃保温1～2小时。用饱和酚抽提数次至界面无蛋白质出现，最后用氯仿-异戊醇抽提一次，加NaCl至0.25～0.3M，再加2～2.5倍体积的冻乙醇，-20℃～-70℃中置1～2小时，10，000～15，000g离心30-45分钟，回收叶绿体DNA，DNA沉淀溶于适量的TE（8-10mM Tris-Cl，1～1.5mMEDTA，pH7.5～8.0）溶液中。