[发明专利]水稻DNA启动子顺序的克隆方法

说明书

本发明属于植物分子遗传工程学。

构建新型的遗传工程载体在高等植物的遗传工程中的作用是十分重要的，对于一个载体来说，除了能够自主复制的顺序和选择标记之外，启动子顺序对于高度表达由载体导入的外源或自身的基因也是必不可少的。一个克隆的基因是否能在新的宿主中高度地表达取决于该结构基因之前的那段启动子顺序能否有效地工作。

目前已有人从烟草叶绿体中克隆了一些DNA片段，这些DNA片段在大肠杆菌中起启动子的作用〔见X.Kon.，.S.Levet and S.D.Kung，Gene 31，23-31（1984）〕。此外，也有从卧龙牙草的叶绿体克隆了启动子顺序（见Hideya FuKuzawa et al，Agric.Biol.Chem.49（9），2725-2731，1985〕。

本发明对传统的DNA启动子顺序的克隆方法进行了改进，运用DNA重组技术，以水稻总DNA或水稻叶绿体DNA为材料，在大肠杆菌克隆受体系统中克隆了一系列启动子顺序，这些启动子顺序在构建水稻人工染色体中是至关重要的。

本发明以水稻总DNA或水稻叶绿体DNA作为供体，以酵母菌和大肠杆菌的穿梭质粒pCH1为载体，该质粒既能在酵母菌中复制又能在大肠杆菌中复制，除了带有一个leu-2（亮氨酸）基因和一个β-lactamase（β-内酰胺酶）基因外，还带有一个缺乏启动子顺序的lacZ（β-半乳糖苷酶）的结构基因，也就是说该基因没有活性。

上述DNA供体及载体首先进行完全酶切，其中载体pCH1DNA完全酶切之后，为了防止自身环化，提高重组频率，增加供体DNA片段插入载体DNA的机会，另外为防止载体DNA中可能存在的细菌染色体DNA的污染，用牛小肠碱性磷酸酯酶进行处理载体DNA。

将供体DNA与载体DNA以2∶1～5∶1的比例混合和连接。连接反应完毕后，将连接反应混合液转化已制备成感受态细胞的大肠杆菌MC1061，在含50～100μg/ml的氨苄青霉素、40μg～60μg/ml的X-gal的LB（蛋白        5～10g、酵母粉2～5g、氯化钠2～3g、pH7.2～7.4）平皿上选择转化子。培养皿在37℃的温度中培养16～20小时，这时平皿上有的菌落开始呈现出兰色。将这些兰色的菌落分别划单菌分离，然后抽提其质粒DNA，用BamHI内切酶分别酶切。琼脂糖凝胶电泳表明，这些从兰色菌落中抽提出来的质粒DNA都带有大小不等的插入片段，杂交试验表明这些不同大小的DNA插入片段来自水稻总DNA或叶绿体DNA。也即得到了能在大肠杆菌中促进外源基因表达的DNA片段，该DNA片段可从水稻总DNA中或者叶绿体DNA中分离得到。

根据上述的方法也可方便地得到从水稻线粒DNA中分离出来的、从水稻染色体DNA中分离出来的能在大肠杆菌中促进外源基因表达的DNA片段，同时也可方便地得到从水稻总DNA（包括叶绿体DNA、线粒体DNA、染色体DNA等）中分离得到的，能促进外源基因表达的任何DNA片段所构成的人工染色体。

上述水稻总DNA供体的制备过程为：水稻种子用10%～15%的消毒剂（安替福民）消毒10分钟～20分钟，25℃～30℃，暗室下培养7～10天后剪下黄化苗上部（ 1/2 - 1/3 苗高），迅速加入液氮，捣碎。在冷冻粉未融之前立即加入提取液（40～50mM Tris-HCl pH8.0～8.5，10～12mM EDTA，0.5～0.7NaCl，1%～1.2%疏基乙醇，0.8%～1%CTAB）。每克冷冻粉加2～3ml提取液。35℃～37℃水浴保温1～2小时，不时轻轻摇动。保温结束后加入等体积氯仿-异戊醇（24～25：1V/V），轻摇10-15分钟，0℃～4℃下5，000～6，000g离心10-15分钟，吸出水相，再重复两次。水相加入等体积的沉淀缓冲液（40～50mMTris-HCl，pH8.0～8.5，10-12mMEDTA，1%～1.2%CTAB），室温下静置30-60分钟后用玻棒挑出丝状沉淀，在0.25～0.3MNaAc        70～75%乙醇中浸洗2～3次，并在该溶液中浸过夜。再用95～100%乙醇浸洗两次，抽干乙醇。最后将玻棒上的沉淀物溶于适量的TE溶液中（8-10mMTris-HCl，1-1.5mMEDTA，pH7.5-8.0）。