[发明专利]类固醇生物化学氧化的方法和用于此方法中的遗传工程方法产生的细胞

说明书

本发明涉及一种制备药学上有用的类固醇的生物化学氧化方法。

11β，17α，21-三羟基-4-孕甾-3，20-二酮（氧化可的松）是一种重要的药用类固醇，由于它的药理性质，可将其作为皮质甾类使用和作为制备许多有用类固醇（特别是其它皮质甾类）的起始化合物。氢化可的松由脊椎动物的肾上腺皮质产生，通过繁杂的提取方法从肾上腺皮质组织中只能原始地得到很少的量，只有在阐明结构后，才发展出一些新的生产途径，这些途径的特点是化学合成步骤与微生物转变相结合。只是因为所采用的初始化合物如甾醇、胆汁酸和皂草配基丰富而且便宜，目前的这些方法提供了不太昂贵的产品，但是这些方法仍然相当复杂。设想了几种改进现行方法的可能性，生物化学的方法也已进行过尝试。

有一种尝试是使用分离的肾上腺皮质蛋白（这些蛋白已知是与类固醇在体内的酶学转化有关）的一个体外生物化学系统，将一合适的初始类固醇转化为氢化可的松。然而，分离这些重要蛋白的困难性和必需的辅助因子的昂贵价格看来使有经济吸引力的大规模生产不能实现。另一种方法是将催化酶保留在其天然环境中并在细胞培养中使肾上腺皮质细胞产生所需的氢化可的松。但是，由于在实践中这些细胞的繁殖率低，要使得这样一种生化方法在经济上具有吸引力看来也是不可能的。

哺乳动物和其它脊椎动物肾上腺皮质中的体内过程构成了一种生化途径，它是以胆甾醇开始的，经由各种中间产物最终得到氢化可的松（见图1）。这种途径中涉及8种蛋白质，其中有5种是酶，而4种是细胞色素P₄₅₀酶，其它3种是电子转移蛋白。

第一步是胆甾醇向3β-羟基-5-孕甾-20-酮（孕烯醇酮）的转化。在这种转化中（即一种单氧化酶反应），涉及三种蛋白质：侧链裂解酶（P₄₅₀SCC，一种含亚铁原卟啉-铁的蛋白），肾上腺皮质铁氧还蛋白（ADX，一种含Fe₂S₂的蛋白）和肾上腺皮质铁氧还蛋白还原酶（ADR，一种含FAD的蛋白）。此外，以胆甾醇作为底物的反应进一步需要分子氧和NADpH。

接着是通过脱氢作用/异构作用将孕烯醇酮转化为4-孕甾-3，20-二酮（孕酮）。该反应由蛋白质3β-羟基类固醇脱氢酶/异构酶（3β-HSD）催化，它需要孕烯醇酮和NAD⁺。

为了得到氢化可的松，再在孕酮的三个位置进行羟化，这种转化由单氧化酶催化。在孕酮转化为17α-羟基孕甾酮时涉及两种蛋白质：

类固醇17α-羟化酶（P₄₅₀17α，一种含亚铁原卟啉-铁的蛋白）和NADPH细胞色素P₄₅₀还原酶（RED，一种含FAD-和FMN的蛋白质）。该反应消耗孕酮，分子氧和NADPH。17α-羟基孕酮转化为17α-21-二羟基-4-孕甾-3，20-二酮（去氧可的松）时也需要两种蛋白质：类固醇-21-羟化酶（P₄₅₀C21，一种含亚铁原卟啉-Fe的蛋白质）和前面提及的蛋白质RED。该反应消耗17α-羟基孕酮，分子氧和NADPH。去氧可的松转变为氢化可的松涉及三种蛋白质：类固醇11β-羟化酶（P₄₅₀11β，一种含亚铁原卟啉-Fe的蛋白质）和上面提及的蛋白质ADX和ADR。