[发明专利]合成杀虫的晶状蛋白质基因

说明书

本发明涉及细菌分子生物学，更具体地说，涉及采用重组技术的基因工程，以防止植物遭受虫害。这里所揭示的是源自苏云金杆菌tenebrionis变种(Btt)的经修饰的晶状蛋白质基因的化学合成，以及这一合成的杀虫基因的选择性表达。还揭示了将经克隆的合成基因转移到一个宿主微生物中，所提到的生物体能够在经改进的表达水平上生产一种对昆虫具有毒性的蛋白质。本发明使通过细菌和植物的基因工程，获得所需要的具有农业价值的新型毒素的表达水平。

苏云金杆菌(Bt)是唯一能在孢子形成过程中产生蛋白质晶状内涵物，后者被认为对于几种农业上重要的害虫具有很高的毒性。不同的Bt菌株的晶状蛋白质具有相当窄的宿主范围，因此在商业上被用作为选择性严格的生物杀虫剂。许多Bt菌株对于鳞翅目昆虫和双翅目昆虫是有毒的。最近报导了Bt的两个亚种(或变种)是鞘翅目昆虫的致病菌：tenebrionis变种(Krieg等人(1983)Z.Angew，Entomol.96：500-508)和san diego变种(Herrnstadt等人(1986)Biotechnol.4：305-308)。两种菌株产生扁平，矩形的晶状内涵物并具有64-68KDa(千道尔顿)的主要晶体组分(Herrnstadt等人，上述；Bernhard(1986)FEMS Microbiol.Lett.33：261-265)。

已克隆了Bt的几个亚种的毒素基因，且发现重组的克隆对鳞翅目昆虫的幼虫具有毒性。两种对鞘翅目昆虫具有活性的毒素基因也已被分离和表达。Herrnstadt等人(上述)克隆了一个5.8Kb(千碱基对)的Bt san digeo变种DNA的Bam HI片段。在E.Coli中表达的蛋白质对P.Luteola(榆木叶甲虫)有毒性，其分子量约为83KDa。从san diego变种基因中得到的这种83KDa的毒素产物比从Bt san diego变种细胞中分离出来的64KDa晶状蛋白质大，表明Bt san diego变种晶状蛋白质在形成一个晶体前被合成为一个较大的前体分子，它是由Bt san diego变种而不是E.Coli加工完成的。

Sekar等人(1987)在Proc.Nat.Acad.Sci.USA84：7036-7040；美国专利申请第108,285号(1987年10月13日提出)中从Btt中分离得到晶状蛋白质基因并测定了核苷酸顺序。该晶状蛋白质含有一个5.9Kb的Bam HI片段(pNSBF544)。含有源自pNSBF544的3Kb Hind III片段的亚克隆被构建。该Hind III片段含有一个编码约73KDa的644个氨基酸多肽的开放式阅读框架(ORF)。两种亚克隆的提取物对科罗拉多土豆甲虫(Leptinotarsa decemlineata，一种鞘翅目昆虫)的幼虫有毒性。与抗tenebrionis变种蛋白质的抗血清有交叉反应的73-和65KDa的肽在E.Coli中表达产生。孢子形成的tenebrions变种细胞含有与pNSBP544的ORF的产物相应的免疫反应性73KDa肽。但是，所分离的晶体主要包含65KDa组分。当晶状蛋白质基因的N-末端区被缩短时，所得到的主要的蛋白质产物是65KDa肽。缺失衍生物p544 Pst-Met5系用酶从5.9Kb Bam HI片段的N-末端移去46个氨基酸残基而衍生得到的。N-末端缺失衍生物p544Pst-Met 5的表达导致几乎全部产生65KDa蛋白质。最近，Me Pherson等人(1988)在Biotechnology 6：61-66中证明了Btt基因在同一个阅读框架中含有两个功能性转译启始密码子，导致全长蛋白质和N-末端截短的形式均被产生。

从几个Bt菌株中得到的嵌合毒素基因已在植物中表达。在土壤杆菌TR-DNA的2′启动子的控制下的得自berliber变种1715的四种经修饰的Bt2基因被转移至烟草植物中(Vaeck等人(1987)Nature 328：33-37)。当截短的基因在基因转移的植物中表达时，毒素产生了杀虫能力。但是，在基因转移的植物中稳定状态mRNA浓度是如此之低，以至它们不能用Northern印迹分析法而可靠地检测，因此要采用核糖核酸酶保护实验进行定量。在产生最高水平蛋白质的植物中Bt mRNA的水平与约0.0001％的poly(A)+mRNA相当。