[发明专利]微生物发酵法生产青霉素酰化酶

说明书

本发明是关于用微生物发酵法生产青霉素酰化酶（Penicillin    acylase）的方法。

由于青霉素耐药菌的普遍产生，一批疗效高，毒付作用低，抗菌谱广的半合成青霉素成为控制感染的主要药物。青霉素酰化酶能水解青霉素产生6-氨基青霉烷酸（6-APA），6-APA是制造半合成青霉素的重要中间体。微生物产生的青霉素酰化酶有胞内酶和胞外酶，对制备固定化酶来说胞外酶不需破坏细胞壁释放酶，易于分离纯化，是制备固定化酶的理想酶原，而胞内酶破壁较麻烦，提取较困难。

为得到高产青霉素酰化酶产生菌，已建立了许多种筛选，诱变和得到工程菌的方法。日本专利丁59183692号报导了用紫外线和高能量的射线处理大肠杆菌，得到的突变株具有高的青霉素酰化酶活性或7-氨基头孢氨酸（7-ACA）活性。南朝鲜的Son等用紫外线诱变巨大芽胞杆菌，酶活提高3-4倍，在最适的培养条件下酶产量可增加7-8倍，所用的出发菌ATCC14945在没有苯乙酸存在时不产生酶（J.Gen.Appl.Microbial.28.281-291.1982.）中国科学院上海药物所杨胜利等人用遗传工程的方法构建了青霉素酰化酶产生菌大肠杆菌A56（PA22）活性比大肠杆菌原株高2-4倍，酶活达200-300u/100ml（NIPAB法）。英国专利GB2142336描述了一种用重组DNA技术增加青霉素酰化酶产量的方法，从酰化酶产生菌巨大芽孢杆菌分离能提高青霉素酰化酶产量的基因片断，引入来自枯草芽孢杆菌的质粒，得到的重组质粒转化青霉素产生菌巨大芽孢杆菌，得到的菌株产酶量比原株高20%。

用青霉素酰化酶生产6-APA有固定化细胞和固定化酶两条路线，过去国内的研究主要集中在产胞内青霉素酰化酶的大肠杆菌及固定化细胞生产6-APA的研究上，1979年已完成了固定化细胞生产6-APA的工艺。但存在着由于菌种活力不高，固定化细胞比活不高，投料浓度低，裂解液要经浓缩提取6-APA等缺点。

本发明的目的在于通过物理和化学因子处理得到产高酶活胞外酶的菌株，结合发酵条件的研究进一步提高酶产量，经分离提纯所得的酶可直接用于固定化酶生产。

实施方案总体介绍如下：

将土样磨细或用水稀释到适当浓度，喷涂到制备好的分离平皿上，28℃培养24小时菌落长出，盖上沾有NIPAB（6-硝基-3-苯乙酰胺基苯甲酸）的滤纸片、纸片上的NIPAB接触产青霉素酰化酶的菌落就被分解成3-氨基-6-硝基苯甲酸，呈现黄色。把产有黄色的菌落接种到斜面上，再经摇瓶发酵测定酶活力从数百个菌株中选出酶活在50μ/100ml以上的菌株10个，菌大小均为0.9-1.0×2.5-4.0μ，具有中生芽孢，孢子不膨大等菌学特征，鉴定为巨大芽孢杆菌（Bacillusmegaterium），从中复筛出较好菌株诱变。

对高活力菌株进行单株分离，用物理和化学因子进行反复诱变处理，处理因子包括紫外线（UV）、亚硝基胍（NTG），氯霉素（cm），氯化锂（LiCl），挑选酶活高的单菌落继续诱变处理。所得的突变株巨大芽孢杆菌81号为国内外所见报导的青霉素酰化酶产生菌中活力最高。在最适的发酵产酶条件下，摇瓶发酵可达700-800μ/100ml，最高达820μ/100ml（NIPAB法），比较了原菌株和突变株的菌学性质和产酶条件，原菌株菌落表面光滑，呈乳白色，凸起，菌体粘稠，菌体细胞细小，而突变株菌落表面粗糙，有条纹，稍带黄色，菌体干燥，菌体细胞粗大。苯乙酸为青霉素酰化酶的诱导剂，突变株和原株在没有苯乙酸存在下都能产生酶，但酶活力较低。加入苯乙酸随着苯乙酸用量增加，原株当苯乙酸增加到0.4%时酶活力最高，突变株当苯乙酸增加到0.9%时酶活力最高，原株在培养10小时时添加苯乙酸产酶活力最高，突变株在开始培养时加入苯乙酸产酶活力最高。