[发明专利]羊生长激素

权利要求书

1、一种制备分子克隆的方法，该方法包括：

提供

一种编码具有羊生长激素活性的重组多肽的互补DNA(cDNA)顺序；和

一种适当的克隆载体；

连接该DNA顺序和克隆载体，以将该DNA顺序插入克隆载体内形成一个分子克隆。

2、根据权利要求1所述的方法，其中编码重组多肽的互补DNA顺序包括全部或部分拷贝的含有成熟激素的羊生长激素重组多肽编码区，并延伸超出3′端终止密码子。

3、根据权利要求2所述的方法，包括下列主要步骤：

提供一个羊垂体腺源;

从中分离多腺苷酸信使RNA（mRNA）;

在寡聚dT引物存在下用反转录酶处理mRNA，以合成第一条互补DNA链（cDNA）;

运用酶学方法用核糖核酸酶H除去mRNA，并接着用DNA聚合酶Ⅰ合成第二条互补DNA链;和

用T₄DNA聚合酶处理如此形成的双链互补DNA（cDNA）以产生平（钝）端分子。

4、一种制备质粒的方法，该质粒带有一个能编码具有羊生长激素活性的重组多肽并能够在单细胞生物中复制、转录和翻译，此方法包括：

提供

一个已经去除预定长度DNA顺序的限制性质粒表达载体;和

一个用于编码具有羊生长激素活性的重组多肽、或其一部分的DNA顺序，而且包括一个可满足单细胞生物内转录和翻译调节需要的合成的5′端顺序;和

将该DNA顺序连接到限制性质粒表达载体上。

5、根据权利要求4所述的方法，其中限制性质粒表达载体来自双起点载体质粒pMG197。

6、根据权利要求5所述的方法，其中用于编码重组多肽的DNA顺序包括只有编码羊生长激素的一部分DNA顺序，它由一个合成的5′端顺序和一个3′端顺序组成，所说的方法还包括：

提供另一个包括编码羊生长激素的完整DNA顺序的剩余部分的DNA顺序：

在合成的5′端顺序和3′端顺序之间的限制性位点处切割所说的DNA顺序;和

再将所述的另一个DNA顺序连接到限制性位点上。

7、根据权利要求6所述的方法，其中合成的5′端顺序由第一个寡聚核苷酸和第二个寡聚核苷酸组成，所述第一个寡聚核苷酸选自包括一个 5′Bg l Ⅱ粘着端、一个与在成熟羊生长激素多肽中没有的NH₂一末端蛋氨酸残基相应的起始密码子（ATG）、一些与自然激素（成熟形式）的氨基酸1-15相应的密码子和于核苷酸160的HgiAⅠ位点相应的3′悬突处终止的寡聚核苷酸;

所述第二个寡聚核苷酸带有5′Bgl        Ⅱ和3′Hgi        AI粘着端，但是它在一个与自然的蛋氨酸残基（氨基酸5，成熟激素）相应的密码子起始，后面跟着代表氨基酸6-15的密码子。

8、一种质粒表达载体，该载体包括一个可编码具有羊生长激素活性多肽的DNA顺序，选自如前所述的pMGoGH1和pMGoGH2。

9、一种具有羊生长激素活性的重组多肽的生产方法，该方法包括下列步骤：

提供

一种重组质粒表达载体，该载体包括一个可编码具有羊生长激素活性的多肽并能在单细胞生物中复制、转录和翻译的DNA顺序，和

一种单细胞生物;

通过转化、转导或转染中的一种方法，将所说的重组质粒表达载体导入单细胞生物内。

培养所得到的生物体;

表达由所说DNA顺序编码的重组多肽;和

从培养物中选择地分离所说的多肽。

10、根据权利要求9所述的方法，其中的单细胞生物是从大肠杆菌DNI1和大肠杆菌IB392中选择的一种大肠杆菌菌株。

11、根据权利要求10所述的方法，其中包括一个可编码具有羊生激素活性多肽的DNA顺序的重组质粒表达载体是pMGoGH1或pMGoGH2。

12、一种兽药用组合物，它包括从oGH1-191或oGH5-191中选择的具有羊生长激素活性的重组多肽及其兽医药上可接受的盐和一种或多种兽医药上可接受的载体。