[发明专利]羊生长激素无效
申请号: | 89108362.6 | 申请日: | 1989-09-29 |
公开(公告)号: | CN1046189A | 公开(公告)日: | 1990-10-17 |
发明(设计)人: | 马尔科姆·罗伊·布兰登;蒂莫菲·爱德华·阿当斯 | 申请(专利权)人: | 邦奇(澳大利亚)有限公司 |
主分类号: | C12N15/18 | 分类号: | C12N15/18;C12P21/00;A61K37/36 |
代理公司: | 中国专利代理有限公司 | 代理人: | 曹恒兴 |
地址: | 澳大利亚*** | 国省代码: | 暂无信息 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 生长激素 | ||
本发明涉及一种重组羊生长激素,一种羊生长激素基因的生产方法,和用于在原核生物内表达和纯化高水平羊生长激素的质粒表达载体的构建方法。
生长激素(一种多肽激素)是在垂体前叶中以大的前体分子形式合成的,由酶从该前体上切割下单肽,产生具有生物活性的成熟生长激素。生长激素,更恰当地说是一种全身组织代谢因子,可以在哺乳动物和其他脊椎动物体内产生大量的生理效应。它是一种骨骼生长促进因子和一种蛋白合成增效剂。生长激素还表现出胰岛素强化特性,具有弱的催乳活性,并且在脂类代谢和保持自身稳定方面起着一定的作用。关于生长激素,有一定程度的种族特异性,如牛的生长激素在人或猴体内不具有活性,但在鼠和山羊体内会产生效应。
在羊饲养业中,使用生长激素可以提高食物转化率,从而增加体重并改善生肉的质量。这可以从共同未决澳大利亚专利申请62522/86中得到解释,为了便于参考,该申请的整个公开技术列入本申请,不过,尽管在羊饲养业中生长激素的使用尚存在经济方面可行性的困难,但现有自然的、从垂体中提取的羊生长激素仍远远供不应求。如果产品具有种族特异性,就不能使用其他自然产生的生长促进多肽。尽管如此,重组DNA技术的发展及应用可以对编码羊生长激素的DNA顺序进行操作,并在原核生物(如细菌)内生产高水平的这种蛋白。
因此,本发明的目的就是解决,或者至少缓解现有技术中的一个或几个困难。尤其是我们已经能够运用后面所描述的方法较大量地生产具有良好羊生长激素活性的重组多肽。这些多肽具有良好的生物活性,而且可以在体内做为自然激素的有效代用品。
因此,本发明的第一个方面是提供一种制备分子克隆的方法,该方法包括:
提供
一种用于编码具有羊生长激素活性的重组多肽的互补DNA(cDNA)顺序;和
一种合适的克隆载体;
连接该DNA顺序和克隆载体,使该DNA顺序置于克隆载体内形成一个分子克隆。
如此形成的载体包括该羊生长激素多肽编码区的完整或部分拷贝(它包括成熟的激素)并延伸超出该3′末端密码子。
用于编码具有羊生长激素活性多肽的DNA顺序可从由羊垂体腺中分离出的多腺苷酸信使RNA中提取。
因此,本发明的另一方面是,提供了一种用于编码具有羊生长激素活性多肽的DNA顺序的制备方法,该方法包括下列主要步骤:
提供羊垂体腺源;
从中分离多腺苷酸信使RNA(mRNA);
在寡聚dT引物存在下用反转录酶处理mRNA以合成第一条互补DNA(cDNA)链;
用RNA酶H除去mRNA,然后用DNA聚合酶Ⅰ合成第二条互补DNA链;和
用T4DNA聚合酶处理如此形成的双链互补DNA(cDNA)以产生平(钝)端分子。
从羊垂体腺中分离多腺苷酸RNA的步骤可以采用任何合适的方法,例如,运用胍硫氰酸盐处理法和亲和层析法。
可以从许多原核克隆载体中选择适合本发明的克隆载体。已经发现噬菌体病毒载体λgt 10和类似物适合于本发明。
连接步骤可以采用合适的形式,克隆反应步骤可以是通过加上合成DNA衔接物进行的连接作用,在这种情况下,用T4DNA连接酶在钝端cDNA分子的任何一端上,连上与Eco RⅠ限制酶识别顺序相应的衔接物。
用酶Eco RⅠ对前面所述的cDNA进行消化,可以产生带有5′Eco RⅠ粘着悬突端的cDNA分子。
然后可以通过连接作用将这些分子克隆到gt 10里的合适Eco RⅠ DNA位点中去;然后将这种DNA“在体外”包进病毒颗粒中,再用它感染合适的细菌微生物,以产生一个重组cDNA库,从该重组cDNA库中可以选择含有可编码羊GH cDNA顺序的重组克隆。
因而,本发明的一个优选方案是,该分子克隆可以从如后面描述的称为OGH1-12和OGH1-14的克隆中选择的一种噬菌体克隆。
这些噬菌体克隆样本已在保藏中心进行了保藏,该保藏机构是Bunge(Australia)Pty.Ltd.North Melbourne,Victoria,Australia。
优选克隆是噬菌体克隆OGH12,该指定克隆包含有一个完整拷贝的羊生长激素多肽编码区(其中包括不翻译的5′和3′侧翼顺序)。已经测定了OGH12的完整DNA顺序,由图1表示。
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