[发明专利]福菇肽的发酵提取工艺及其测定方法

权利要求书

1、一种利用链霉菌经发酵提取生产酸性旦白酶抑制剂(即福菇肽)的福菇肽的发酵提取工艺，其特征在于：它利用了一种被命名为福东链霉菌(Streplomyces fudongusn.sp.)的新种，经过砂土管菌种、斜面菌种、种子瓶、种子罐(一级发酵罐)、发酵罐(二级发酵罐)等发酵工序，获得富含福菇肽的发酵液，再经过离心或板框压滤、大孔树脂床吸附、低级醇洗脱、减压浓缩的提取工序即得产品。

2、根据权利要求1所述的发酵提取工艺，其特征在于：

a、选用经选充得到的活性高的福东链霉菌作为福菇肽生产菌，并将该菌转入砂土管保存，供随时取用，

b、将保存于砂土管中的生产菌移入斜面培养基中，在26～32℃下保温培养6～15天后移入种子瓶中，

c、在种子瓶中装入占种子瓶体积8～20%的培养基，摇瓶，在26～32℃下发酵32～48小时后，移入种子罐或发酵罐中，

d、种子罐体积一般为200立升和500立升，相应的发酵罐体积则为500立升1.5吨或5吨罐，培养基装量为罐体积的1/2～2/3，按培养基量的0.01%～0.1%加入消泡剂，经低压消毒后，并按培养基量的1%～5%接种，在空气流量为0.1，罐压为0.3～0.4千克/厘米，搅拌速度为120～250转/分，温度为26～32℃的条件下发酵，种子罐的发酵时间为20～30小时，发酵罐的发酵时间为48～50小时即可达活力高峰期，

e、各阶段培养基成分如下：

（1）斜面菌种培养基：

旦白胨2克、肉膏4克、乳糖6克、葡萄糖2克、KNO₃1克、K₂HPO₄1克、MgSO₄1克、H₂O 1升、琼脂24克、PH 7.0，

（2）种子瓶培养基：

葡萄糖10克、淀粉15克、肉膏5克、旦白胨5克、NaCL 1克、K₂HPO₄0.2克、微量盐1毫升（CuSO₄·5H₂O 0.0007克/升、MnCL₂·4H₂O 0.0008克/升、ZnSO₄·7H₂O 0.0002克/升）CaCO₃3克、H₂O 1升、PH 7.0，

（3）种子罐（或发酵罐）

培养基成分与种子瓶相同，但200立升种子罐应加30毫升消泡剂，500立升种子罐（或发酵罐）应加80毫升消泡剂。

f、从发酵罐中放出的发酵液，经过滤除去菌丝体，得到发酵清液，用酸调节PH呈酸性后搅拌，除去大分子沉淀物后，再将所得清液回调PH至中性，然后上树脂床进行吸附，其流速为200毫升/分～400毫升/分，待穿透后用蒸馏水淋洗树脂床至流出液无色，最后用低级醇洗脱，洗脱液经减压浓缩后即得福菇肽产品。

3、一种测定福菇肽（酸性旦白酶抑制剂）含量的抑酶显影测试法：其特征在于：

a、制备测定平板：

量取0.4～0.6%酪旦白10毫升，加入2%～4%水琼脂10毫升，混合均匀冷却至45℃，然后加入1毫克/毫升的胃旦白酶1毫升，混合均匀后倒板，待其凝固后即可供测定用。

b、配制测定试样与标准液

ⅰ、将待测液按实际需要用PH＝2的KCL-HCL缓冲液稀释成一系列浓度不同的测定试样。

ⅱ、将标准品准确称量至10^-1毫克，然后用KCL-HCL缓冲液配制成1微克/毫升和4微克/毫升两种标准液。

c、测定

用微量吸液器分别吸取5微升的一系列测定试样和标准液，滴在预先准备好的直径相同的圆纸片上，然后依次贴在预先制备好的测定平板上，将此平板放在37℃恒温箱中保温3～4小时，然后将该测定平板上的测定组与标准组进行比较，确定大小相当于标准样的相应圆斑，然后计算出活力单位。稀释倍数×标准液单位＝样品活力单位。