[发明专利]制备胰高血糖素的方法无效

专利信息
申请号: 90101167.3 申请日: 1990-02-01
公开(公告)号: CN1063795C 公开(公告)日: 2001-03-28
发明(设计)人: 石崎顺;玉木幹男;新优;寺冈宏;吉田信男;续木博茂 申请(专利权)人: 盐野义制药株式会社
主分类号: C12P21/00 分类号: C12P21/00
代理公司: 中国专利代理(香港)有限公司 代理人: 曹恒兴
地址: 日本*** 国省代码: 暂无信息
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摘要:
搜索关键词: 制备 血糖 方法
【说明书】:

本发明涉及制备胰高血糖素融合蛋白质、然后用酶处理并回收以生产胰高血糖素的有效方法,还涉及该生产方法中使用的编码胰高血糖素的DNA顺序,含有该DNA顺序的表达载体,以及携带该表达载体的转化体。

胰高血糖素(glucagon)是一种由胰岛A细胞分泌的肽激素,与胰岛B细胞分泌的胰岛素一起对碳水化合物代谢起着重要作用。胰高血糖素还是一种已知的高血糖-糖原分解因子(HGF);胰岛素可增进葡萄糖代谢并降低血葡萄糖水平,胰高血糖素则可使葡萄糖释入血中从而提高血糖水平。由于这些性质,故可使用胰高血糖素来试验生长激素的分泌、诊断胰岛瘤、进行糖元积聚试验、紧急治疗低血糖、在消化道的射线照相和内窥镜检查中作预处理及其他临床应用。

胰高血糖素的氨基酸顺序是已知的;其分子是由29个氨基酸组成的单股肽链,氨基末端是组氨酸;羧基末端是苏氨酸(见图11)。人、猪和牛胰高血糖素的氨基酸顺序是一样的,因此工业上可由牛或猪胰腺中分离并提纯胰高血糖素。市场上可以买到以这种方法生产的胰高血糖素产品。再者,James W.White和Grady F.Saunders(Nucleic Acids Research 14,4719-4730,1986)已经阐明了编码胰高血糖素的人DNA顺序(见图11)。自此,人们已将注意力转向尝试用DNA重组技术经济地大量生产胰高血糖素。

然而,如上所述,胰高血糖素是含29个氨基酸残基的短链肽,故分子量很低。当用DNA重组技术由宿主细胞分泌这种低分子量蛋白质时,它们将会被存在于宿主细胞内的蛋白水解酶降解。因此,如果使这种低分子量蛋白质与其他蛋白质结合成更为稳定的、有适当大小的融合蛋白质来表达,将是很有利的。这样,然后即可以用化学或酶方法处理这些融合蛋白质,分离出目的蛋白质。例如,日本专利公开63-284196号中介绍了一种以化学法处理融合蛋白然后回收目的蛋白质的方法。但化学处理常常伴有不利的付反应。另外,日本专利公开62-246600号描述了一种酶法处理融合蛋白以分离目的蛋白质的方法,其中是用谷氨酸特异性蛋白酶处理含表皮生长因子(EGF)的融合蛋白质,进而回收EGF这一目的产物。但已知EGF含有四个谷氨酸残基,因而使用这种酶难以回收到完整的EGF,而且收率很低。迄今为止,还没有一个经酶处理由融合蛋白中分离胰高血糖素的有效方法。

本发明生产胰高血糖素的方法,克服了现有技术中的上述缺陷及其他许多缺点和不足,该方法包括:

制备通式(Ⅰ)所示的融合蛋白:

        X-Glu+Glucagon          (Ⅰ)其中X是70-170个氨基酸的先导顺序,Glu是谷氨酸残基,Glucagon代表胰高血糖素的氨基酸顺序,以及

用能够在谷氨酸残基的羧基末端特异地水解肽键的酶处理所说的融合蛋白,以裂解该融合蛋白。

在一优选方案中,用包括下列步骤的方法回收胰高血糖素:

(a).用适当的变性剂或表面活性剂溶解所说的融合蛋白质;

(b).降低所说变性剂或表面活性剂的浓度;

(c).向步骤(b)得到的混合物中加入酶,从而得到一种含有因融合蛋白部分分解而产生可溶性中间产物的反应混合物,

(d).将所说的反应混合物除盐,得到含有所说的中间产物和酶,但不含有所说的变性剂和表面活性剂的部分,

(e).借助含在所说部分中的酶使反应继续进行,以释放出胰高血糖素,以及

(f).分离释放的胰高血糖素。

本发明的表达载体具有编码上述融合蛋白的DNA顺序,并可在大肠杆菌宿主细胞中有效地表达所说的融合蛋白质。

本发明的转化体是向大肠杆菌细胞内导入上述表达载体而得到的。

本发明编码胰高血糖素的DNA顺序可用下式表示:

5′-CACTCTCAGGGTACCTTCACTTCCGACTACTCTAAA        TACCTGGACTCCCGTCGTGCTCAGGACTTCGTTCAG

    TGGCTGATGAACACC-3′            (Ⅲ)

本发明的纯化胰高血糖素,纯度达99%或更高,所说的纯度是用高效液相层析法测定的。

因此,本发明可达到下述目的:

(1)提供一种生产胰高血糖素的方法,其中制备了含胰高血糖素的融合蛋白质,并以高效率用酶处理以回收胰高血糖素;

(2)提供一种按上述方法使用小量酶,生产与天然产物相同之胰高血糖素的方法;

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