[发明专利]一种曲霉纤维素酶菌种的制备方法

说明书

本发明涉及的是一种曲霉纤维素酶菌种的制备方法及这种菌种在酿造工业中的应用，具体地说是提供一种被称为EA181的曲霉纤维素酶变株的生产方法及利用所生产的曲霉纤酶EA181在酿造工业中的实际应用。

近二十年世界各国对纤维素酶的研究进展较快，日本已在食品加工、酿造、医药、化工等方面获得广泛应用。美国、巴西、印度、苏联等国开展利用纤维素酶水解工业废纤维发酵酒精的研究已进入中试阶段，但是所用纤维素酶活力较低。我国曾在白酒生产、酱油酿造、食品加工与提高粗饲料营养价值等方面进行过纤维素酶的应用研究。但由于菌种活力较低，成本较高，菌种多属木霉，有毒性嫌疑，在食品发酵工业中未获得实际应用。

本发明的目的是提供一种制备高活力纤维素酶菌种的方法，并将所制备的高活力菌种应用于食品酿造工业的生产中。

本发明的曲霉纤维素酶菌种从具有纤维素酶活性的野生菌株分离、筛选出菌株，称原菌株，对其进行紫外线、秋水仙碱、硫酸二甲脂，亚硝酸及亚硝基胍中二种或多种过程。连续诱变处理而获得的一种高活性纤维素酶变株。这种原菌株菌落特征为：在查氏琼脂25℃7天菌落直径4.0～4.6cm，中间灰白色、边缘褐色、绒毛状，从中心到边缘均有沟纹，背面中央浅褐色，边缘白色，10天菌落5.5～6.0cm，边缘淡紫色与形成黑色分生孢子，中央白色带浅黄，14天部分中心区孢子也呈黑色，背面中央浅褐色，边缘白褐色。分生孢子头成束，顶端散开，部分分叉，分生孢子梗光滑无色，小梗单层，浅褐色，顶囊浅褐色16-24×18-28μ，分生孢子圆形，黑色有明显小刺，根据曲霉鉴定手册（Raper.K.B.etal.the  genus  Aspergillus.Williamas  andwilkins  co.Baltimore.293～344  1965）此菌株鉴定为黑曲霉群（AsPergillus  niger），日本曲霉（Aspergillus  japonicus）。由这种原菌株经诱变育种而得到的本发明制备的新的高活力曲霉纤维素酶EA181变株现，寄存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，登记入册的编号为160。

EA181变株培养特征为：生成较原菌株慢，在查氏琼脂25℃7天菌落直径3.5～4.0cm，背面淡黄色，10天，菌落5.5～6.0cm，中间白色转灰黄，带淡紫色，有放射状沟纹，14天中间淡紫色，边缘孢子呈器色。此菌株最适产酶培养基成分为：以花生秸、苞米秸、谷草、稗草粉为碳源，用麸皮作氮源，再加以不同无机氮作补充氮源配成的营养盐溶液PH5.9～6.2进行固态培养EA181变株均能良好生长。但酶活性以谷草粉为碳源，硝酸铵、硝酸钠或硫酸铵的一种或二种混合无机盐溶液为补充氮源配成的培养基为最佳成份，且麸皮占固体粉料10～40%（重），营养盐溶液中无机氮含量占总N量0.1～1%（重），其较佳用量为0.2～0.4%（重）。此外，最适产酶PH值为5.9～6.2，温度为28～30℃，培养时间为120～150小时。为测酶活性，对固态曲酶活性测定是先将2克生成好的三角瓶固态曲，加水40ml，于30℃保温1小时，过滤得1∶20酶提取液，用DNS定糖的方法测定此酶液分解CMC（羧甲基纤维素钠）、滤纸、棉花与β-葡萄糖苷（水杨苷）酶活性，液体曲是直接用滤纸过滤同上法测定酶活性。下面通过实例进一步说明本发明提供的新EA181变株的制备过程和在酿造工业上的应用。

实例1  曲霉原菌株诱变、育种

对曲霉原菌株进行紫外线、秋水仙碱、硫酸二甲酯等连续诱变处理可获得高活性曲霉纤维素酶EA181，其诱变处理过程对变株酶活性的影响如表1。

表1  不同诱变处理对变株酶活性的影响

由表1所示结果，原菌株经连续诱变处理累计提高分解CMC与滤纸酶活性3倍，棉花酶活性3.7-3.9倍，本发明选定最后处理得到的变株为EA181。

实例2，EA181变株制备

用实例1得到EA181变株菌株，以谷草粉7克，麸皮3克，营养盐溶液（NaNO₃和（NH₄）₂SO₄分别取溶液重量的1.5%，0.8%）25ml配成培养基，PH5.9～6.2，菌株培养120～140小时。得到产品EA181变株酶活性测定为，该酶分解CMC，滤纸，棉花及水杨苷酶活性分别为7600～8100;270～310;380～410及2300～2600mg葡萄糖/gh。

实例3，EA181变株毒性试验