[发明专利]大肠杆菌疫苗的制备方法

说明书

本发明涉及一种保护个体免受大肠杆菌(E·Coli)感染的疫苗，在该疫苗中使用的一种毒素以及该毒素纯化的方法。

大肠杆菌(E·Coli)是一种普遍存在的细菌，它们群集于大多数动物的消化道。通常，这种菌的繁殖不会产生严重的反作用，在大多数情况下，该细菌起着对寄主有利的作用。但是，大肠杆菌(E·Coli)偶尔也引起严重的疾病，尤其是在年幼动物。这种情况在鸟类和商业上进行的家禽繁殖中也会出现。感染后引起传染病，导致严重的弱质病或年幼鸟类的大批死亡。

自然，已经尝试过用接种方法控制E·Coli感染家禽。为实现这个目的，已用菌苗(失活的大肠杆菌)接种成年鸡(AvianDisease 29(4)，1108-17(1985))。菌苗的缺点是伴随有严重副作用。再者，菌苗接种后开始时产生抗脂多糖的抗体，该抗体仅对E·Coli O血清型有特异性，因而不能保护个体免受其它血清型的E·Coli的感染。

另外，常使用以E·Coli菌的繖毛为基础的疫苗抵抗该菌的感染。但是，这些疫苗仅产生有限的保护作用，受保护的个体数不超过接种个体的80％，基于这个原因，大肠杆菌疫苗常包含另外一种毒性因子成份：失活的E·Coli毒素。

许多种类的E·Coli含有对菌体游动起作用的鞭毛。以前由于没有认识到E·Coli的鞭毛可作为一种毒性因子，因而没有用于E·Coli疫苗中。

根据本发明，业已发现大肠杆菌鞭毛与对Vero细胞的极强毒性有关(这种相关性至今没有被认识)，且这些鞭毛蛋白毒素是一个重要的毒性因子。

基于上述发现，已制备出源于E·Coli鞭毛的疫苗。根据本发明所述，可利用E·Coli的完整鞭毛，也可以是所说鞭毛的亚结构单位，如鞭毛蛋白或鞭毛蛋白片段或集合体，它们能保护接种个体免受E·Coli感染。

在用大量E·Coli菌株进行的实验中(这些菌株主要是从鸡也包括从其它动物和人体中分离到)，发现鞭毛与对Vero细胞的毒性有关。这种毒性能被该鞭毛的抗体中和。经进一步证明发现，用于研究的所有E·Coli菌株的鞭毛毒性可被一种菌株的鞭毛的单一抗血清所中和。

基于这一发现，期望能用来自于单一E·Coli菌株的鞭毛接种个体而使之免受所有具有鞭毛的E·Coli菌株的感染。

基于上述考虑，本发明所述的疫苗是以在E·Coli中发现的一类新毒素为基础的，其特征是它们具有蛋白质的性质，且存在于鞭毛中和／或与鞭毛相关联，由SDS-PAGE测得的分子量在30～100KD之间，没有结合糖残基，对Vero细胞和一日龄小鸡有毒，在100℃加热1小时仍保持毒性。

兼有上述特性使这些新毒素和本领域内已知的E·Coli毒素相区别。

在大量E·Coli菌株中存在有上述的毒素，由于该毒素明显地存在于鞭毛结构中,本文将此命名为鞭毛毒素(FT)。一般情况，这些鞭毛比正常繖毛(典型繖毛直径为7nm，最长长度为1μm)大得多，最大可达25nm粗，7μm长。

根据实施例1概述的步骤，本发明所述的毒素种类之一是从小鸡E·Coli CH7(015∶K14∶H10)菌株中分离到的。分离出的CH7-FT以几种形式存在：可以是H10型的天然鞭毛，或是游离毒素，或由游离的毒素重新结合成的针状细丝。除前面介绍的一般特性外，CH7-FT的典型特性是由SDS-PAGE测得的亚单位的分子量约47KD，等电点PH值约为4.8，NH2-末端的部分氨基酸序列：Ala-Gln-Val-Ile-Asn-Thr-Asn-Ser-Leu-Ser-Leu-(?)-Thr-Gln。(CH7-FT的特性见实施例2的描述)。

抗CH7-FT的抗血清与用于试验的所有其它E·Coli菌株的FT发生交叉反应(见实施例3)，因此，CH7-FT的抗血清能用于对本发明所述的所有其它FT进行定性。再者，制备的单克隆抗体或者是特异性的或者与试验用的所有其它E·Coli菌株的FT发生交叉反应。

本发明也包括具抗E·Coli感染的免疫活性的疫苗，该疫苗的活性成分是一种本发明所述的失活的毒素。

该疾苗适当地含有所说的毒性鞭毛，通过在有利于鞭毛形成的条件下培养EColi细菌，从细菌中分离出鞭毛或不含细胞的上清液可很容易地获得这种鞭毛，然后利用超过滤和/或分子筛色谱法除去上清液中低分子量成分进一步纯化FT。

在纯化过程中，利用FT与CH7-FT的单克隆抗体的反应性监测富含FT的部分。

本发明所述疫苗还包括能保护接种个体免受E·Coli感染的FT的一个片段。