[发明专利]重组生长因子无效

专利信息
申请号: 90108420.4 申请日: 1990-10-11
公开(公告)号: CN1051198A 公开(公告)日: 1991-05-08
发明(设计)人: 罗伯特·约翰·穆尔 申请(专利权)人: 皮特曼-穆尔澳大利亚有限公司
主分类号: C12N15/09 分类号: C12N15/09;C12N15/74;C12P21/00;C12P19/34;A61K37/36
代理公司: 中国专利代理有限公司 代理人: 曹恒兴
地址: 澳大利亚新*** 国省代码: 暂无信息
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摘要:
搜索关键词: 重组 生长因子
【说明书】:

本发明涉及重组生长因子及其合成方法,尤其涉及具有表皮生长因子生物活性的重组分子。

各种多肽生长因子已由不同的哺乳类动物中分离得到,并且具有广谱活性,其中表皮生长因子(EGF)和转移生长因子(TGFα)已经进行了广泛深入的研究。

表皮生长因子涉及多种活性,包括促进肠子成熟,从而刺激幼龄动物的生长,以及伤口的愈合。

Moore及其同事们(1982a,b;1983)业已发现,表皮生长因子是一种非常有希望的脱羊毛剂。

羊注射鼠表皮生长因子(mEGF)后,可使羊毛纤维变得很松软,因此很容易迅速地手工去除全部羊毛(Moore等,1983)。采用这种方法可以期望避免传统的剪羊毛方法中所需昂贵的劳务费用和伤害羊的危险。但是从老鼠涎腺中纯化得到的表皮生长因子的量非常有限,费用也过高。

后来在大肠杆菌中通过重组手段产生鼠表皮生长因子的方法的成功,促进了在羊体内进行大量的研究(Allen等,1985;1987)。

这种制备重组鼠表皮生长因子的方法受到许多限制。首先,为了得到稳定的细胞内产物的高水平的表达,需要将鼠表皮生长因子制备成一部分大的融合蛋白,由于该产物仅约含15%的鼠表皮生长因子,其余均为非表皮生长因子载体蛋白。因此,需要表达非鼠表皮生长因子部分减少的融合蛋白。在控制tac启动子-操纵子和具有TrpE核糖体结合位点的条件下,制备Met表皮生长因子和超过表皮生长因子6或7个N端的结构,但是检测不到表达,这是由于宿主细菌中蛋白质迅速分解的缘故(Allen,私人通讯)。其次,融合蛋白必须用特殊的酶或化学方法予以裂解。尽管作了种种认真的努力,将对各种裂解剂敏感的顺序结合到邻近表皮生长因子的顺序(Allen,私人通讯),这项足够有效和专门的技术是使用赖氨酸特异蛋白酶,但也不能在化学上改变鼠表皮生长因子本身,这证明非常不易,而且酶也不能得到可靠的供给。

业已证明,TrpE-表皮生长因子的融合失去了生物活性(参阅本说明书表3),这说明融合蛋白需要裂解。已经发表的工作证明,相关的生长因子TGFα是在体内产生的,这是一种大的前体分子。其大小约为TGFα1的3倍。然而TGFα生物活性仅为游离生长因子活性的1-2%。这说明类似大融合可能也相对失去生物活性(Brachmann等,1989)。

就脱羊毛方法而言,采用该方法生产重组的或质粒衍生的鼠表皮生长因子(rec-mEGF)的费用远高于开发市场商品所容许的费用。其他许多研究工作者也已研究了生产重组体表皮生长因子的方法(例如Oka等,1985;Smith等,1982;Urdea等,1983;Sumi等,1985)。然而这些方法的费用也都很高,一般说来适宜于生产每单位表皮生长因子的价格可以显着高于脱羊毛用的表皮生长因子的那些产品。

已知上述的一个例外是日本专利6240924,其要求保护高水平的表达,但是在明显相似内容的文献中(Oka等1985),却报导了低水平的表达。因此,看来该专利的方法可能仅仅取得部分的成功。

表皮生长因子的应用并不限于脱除上述的绵羊毛,也可应用于其他动物的脱毛,例如可用于收获山羊和兔子的毛,骆驼科动物的毛(如羊驼,无峰驼或骆马),以及在屠宰前去除牛、鹿和猪的鬃毛或其他皮毛。

将表皮生长因子由母体的奶中转移到幼龄哺乳动物,能起到促进肠子生理成熟的作用。对幼龄动物施用表皮生长因子可以加速其成熟,因此可以加速小猪和其他动物的早期生长和提早断奶。在医学上,人表皮生长因子可以促进胃溃疡的愈合,还可用于皮肤和眼睛的伤口愈合。在动物治疗方面,也可进行类似的施用,例如为了避免羊两腿间绿绳叮咬而切除过份松驰的皮肤后,可以加速由此引起的伤口的愈合,尤其是马或狗的溃疡和伤口的愈合。生长因子还可用于细胞和组织的合成或半合成培养基中,尤其用于含有少量血清或不含血清的培养基中。

本发明提供的分子涉及表皮生长因子,但结构上与其不同,基本上具有类似的生物活性,但易于低成本大规模地进行生产。这些特征使这类分子特别适用于某些动物的治疗,可以广泛使用,但单位成本很低。此外,本发明还提供克服以往已知合成方法中存在的问题的方法,而又能连续在重组宿主细胞中大量产生。

虽然本发明着重介绍表皮生长因子,但是表皮生长因子(EGF)和转化生长因子(TGF)之间顺序的同源性说明,本发明还可应用于TGF,应理解为这也属于本发明的范围。

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